一種納塔櫟組織培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)方法，具體為一種納塔櫟組織培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 納塔櫟（必Zercw1S 系高大落葉喬木，樹高20-28 m，直徑30-90 cm。樹 冠廣圓形。葉長(zhǎng)10-20 cm，寬5-13 cm。具有5-7個(gè)深深的裂片。橡實(shí)碩大，長(zhǎng)2-3 cm，卵 形，帶有厚而深的被鱗殼斗。納塔櫟在墨西哥灣沿海平原、密西西比河和紅河流域排水不良 的低地黏土上生長(zhǎng)良好，是這類土地上少數(shù)幾個(gè)具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的樹種之一。
[0003] 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研宄院亞熱帶林業(yè)研宄所于2002-2014年間多次從美國(guó)路易斯阿 娜州引進(jìn)納塔櫟種源，在浙江富陽(yáng)、平湖、紹興、安吉，上海松江、青浦、寶山，江蘇江都、東臺(tái) 等地試種，納塔櫟生長(zhǎng)迅速，表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，年均樹高和胸徑生長(zhǎng)量為I. 2 m和1. 5 cm以上。2003年在上海松江用1年生苗造林，2011年平均樹高12 m，胸徑15. 3 cm，最大胸 徑23. 2 cm。2008年開始結(jié)實(shí)，結(jié)實(shí)量較大，橡樹果吸引了大批的鳥類和動(dòng)物匯集，大大豐 富了林地的生物多樣性。
[0004] 在開闊地栽種，納塔櫟枝葉濃密，主干和分枝粗壯，枝角較大。樹干通直，樹皮有光 滑型和粗裂型2種類型；樹冠均稱，呈圓球形，秋季10-11月間葉片轉(zhuǎn)紅，成為長(zhǎng)三角地帶 重要的彩葉樹種。試驗(yàn)表明，與其它幾種北美櫟樹及國(guó)產(chǎn)麻櫟相比，納塔櫟耐澇性最強(qiáng)。因 此，納塔櫟是優(yōu)良的園林綠化樹種。
[0005] 納塔櫟在原產(chǎn)地每年會(huì)產(chǎn)生大量橡果，因此大多采用種子繁殖，目前國(guó)內(nèi)納塔櫟 苗木大多依賴進(jìn)口種子繁殖，在進(jìn)口種子過(guò)程中，由于機(jī)械損傷、溫度等原因，使得很大一 部分種子在萌發(fā)后得不到及時(shí)播種而喪失活力，導(dǎo)致出苗率低，苗木成本較高。而且，對(duì)于 一些葉色變異的植株，無(wú)性繁殖是種質(zhì)資源保存的重要途徑。國(guó)內(nèi)目前在納塔櫟無(wú)性繁殖 方法方面，僅江蘇省林業(yè)科學(xué)研宄院開展了納塔櫟組織培養(yǎng)研宄，其方法是基于納塔櫟體 細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑而建立的試管苗再生體系（公開號(hào)CN103548679A)，體細(xì)胞胚胎在形成過(guò) 程中要經(jīng)歷外植體脫分化、再分化這一過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中，存在發(fā)生變異的可能性，不利 于優(yōu)良種質(zhì)資源的保存。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種納塔櫟組織培 養(yǎng)方法的技術(shù)方案，該方法采用不定芽增殖途徑，經(jīng)過(guò)不定芽增殖、生根、成苗過(guò)程直接建 立試管苗再生體系，該方法操作簡(jiǎn)易，繁殖系數(shù)高，不僅很大程度上緩解了國(guó)內(nèi)納塔櫟苗木 過(guò)度依賴種子繁殖的難題，節(jié)約了成本；同時(shí)，有效保存了特異的種質(zhì)資源的母本遺傳信 心，為納塔櫟新品系的選育奠定基礎(chǔ)。
[0007] 所述的一種納塔櫟組織培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 外植體的選取：外植體取自野外植株或室內(nèi)培養(yǎng)的幼苗； 2) 外植體消毒：取帶芽莖段作為外植體，外植體經(jīng)自來(lái)水沖洗10-14小時(shí)后，再以 70-75%的酒精消毒25-35秒，然后升汞浸泡3-5分鐘，然后以無(wú)菌水沖洗3-5次，置于無(wú)菌 玻璃瓶備用； 3) 初代培養(yǎng)：將消毒外植體剪成1-1. 5 cm的帶芽莖段接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-30天，給 予光照2500-3500 Lx，光周期14-18 hr/6-10 hr，溫度25°C±2°C;所述的初代培養(yǎng)基由 WPM培養(yǎng)基+6-芐基腺嘌呤0. 8-1. 2 mg/L組成；或者初代培養(yǎng)基由1/4MS培養(yǎng)基+6-芐基 腺嘌呤〇· 8-1. 2 mg/L組成； 4) 不定芽增殖培養(yǎng)：將初代培養(yǎng)基中有生長(zhǎng)跡象的帶芽莖段接入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增 殖培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同步驟3)，培養(yǎng)周期為40-50天；所述的增殖培養(yǎng)基由WPM培養(yǎng)基+6-芐 基腺嘌呤I. 0-1. lmg/L+噻苯隆0. 08-0. 12 mg/L組成；或者增殖培養(yǎng)基由1/4MS培養(yǎng)基 +6-芐基腺嘌呤I. 0-1. lmg/L+噻苯隆0· 08-0. 12 mg/L組成； 5) 壯苗培養(yǎng)：將增殖培養(yǎng)基中葉色濃綠，長(zhǎng)度1-2 cm的不定芽逐個(gè)切下，接入WPM或 1/4MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)25-35天，培養(yǎng)條件同步驟3); 6)生根培養(yǎng)：將壯苗培養(yǎng)后健壯的芽切去基部褐色物質(zhì)和愈傷組織接入生根培養(yǎng)基 中進(jìn)行生根培養(yǎng)，先暗培養(yǎng)4-6天，以提高根系發(fā)生速率，再光照培養(yǎng)3. 5-4. 5周后生根， 培養(yǎng)條件同步驟3);所述的生根培養(yǎng)基由WPM培養(yǎng)基+生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)4-吲哚-3- 丁酸 I. 0-1. I mg/L 組成； 7)煉苗和移栽：將有生根的納塔櫟幼苗的培養(yǎng)基瓶蓋打開，室溫下煉苗2-4天后，取出 幼苗，洗去根部培養(yǎng)基，移栽裝有河沙基質(zhì)的苗床上，保持溫度20-25°C，濕度85%-95%，適 當(dāng)遮蔭即可。
[0008] 所述的一種納塔櫟組織培養(yǎng)方法，其特征在于步驟1)中： 野外植株：一般應(yīng)在上半年取材，選取當(dāng)年萌發(fā)的帶芽莖段為外植體，野外采集的外植 體，另加入1-2滴吐溫80消毒； 室內(nèi)培養(yǎng)：選取無(wú)蟲眼、顆粒飽滿的納塔櫟種子，在自來(lái)水中浸泡22-26小時(shí)，棄去漂 浮的種子，然后以飽和漂白粉上清液浸泡25-35分鐘進(jìn)行表面消毒，消毒后的種子播種塑 料容器中，容器中覆蓋河沙，河沙厚度為4-6cm，將塑料容器置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度 25±1°C，光照強(qiáng)度 11000-13000LX，光 / 暗周期為 14-18h/6-10h。
[0009] 所述的一種納塔櫟組織培養(yǎng)方法，其特征在于所述的初代培養(yǎng)基、不定芽增殖培 養(yǎng)基、壯苗培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基中分別添加蔗糖15-25 g. Γ1，瓊脂4-7 g. Γ1，以0.1 M氫氧 化鈉調(diào)節(jié)pH至5. 5-5. 9。
[0010] 所述的一種納塔櫟組織培養(yǎng)方法，其特征在于步驟3)中：光照2800-3200 Lx，光 周期15-16 hr/7-8 hr，溫度25°C ±2°C;所述的初代培養(yǎng)基由WPM培養(yǎng)基+6-芐基腺嘌呤 1. 0-1. I mg/L組成；或者初代培養(yǎng)基由1/4MS培養(yǎng)基+6-芐基腺嘌呤1. 0-1. I mg/L組成。
[0011] 所述的一種納塔櫟組織培養(yǎng)方法，其特征在于步驟3)所述的初代培養(yǎng)過(guò)程中需采 取外植體防褐化措施，具體為在初代培養(yǎng)基中加添加初代培養(yǎng)基重量0. 2-0. 4%的活性炭， 或多次反復(fù)轉(zhuǎn)接，即外植體第一次接種后，培養(yǎng)2-3天，轉(zhuǎn)接到相同培養(yǎng)基，這樣轉(zhuǎn)2-3次。
[0012] 所述的一種納塔櫟組織培養(yǎng)方法，其特征在于步驟4)中：所述的增殖培養(yǎng)基由 WPM培養(yǎng)基+6-芐基腺嘌呤I. 05mg/L +噻苯隆0. 1-0. 11 mg/L組成；或者增殖培養(yǎng)基由 1/4MS培養(yǎng)基+6-芐基腺嘌呤I. 05mg/L+噻苯隆0· 1-0. llmg/L組成。
[0013] 所述的一種納塔櫟組織培養(yǎng)方法，其特征在于步驟6)中：所述的生根培養(yǎng)基由 WPM培養(yǎng)基+生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)4-吲哚-3- 丁酸I. 05 mg/L組成。
[0014] 所述的一種納塔櫟組織培養(yǎng)方法，其特征在于所述的WPM培養(yǎng)基由由大量元素、 微量元素、鐵鹽、有機(jī)成分組成； 所述的大量元素為：（〇硝酸銨NH4NO3,400 mg ·ΙΛ (2)硝酸鈣Ca (NO3)2, 556 mg ·ΙΛ (3)氯化鈣 CaCl2 · H20,96mg · ΙΛ (4)硫酸鎂 MgSO4 · 7H20,370 mg · ΙΛ (5)硫酸鉀 K2S04， 990 mg · ΙΛ (6)磷酸二氫鉀 ΚΗ2Ρ04,170 mg · ΙΛ 所述的微量元素為：（1)硼酸 H3BO3,6.2 π^·ΙΛ(2)鉬酸鈉 Na2MoO4 ·2Η20,0· 25 mg·!/1， (3)硫酸錳 MnSO4 · 4H20, 22. 3 mg · ΙΛ (4)硫酸銅 CuSO4 · 5H20,0· 25 mg · L' (5)硫酸鋅 ZnSO4 · 7Η20,8· 6 mg · L S 所述的鐵鹽為：⑴乙二胺四乙酸二鈉 Na2 · EDTA，37. 3 mg · ΙΛ⑵硫酸亞鐵 FeSO4 · 7Η20,27· 8 mg · Γ1; 所述的有機(jī)成分為：（1)肌醇(；!112062!120，10〇11^噸- 1，（2)煙酸從：5!14,0)0!1，0.5 1^噸-1， (3)鹽酸硫胺素 C12H17ClOS · 2HC1，I. 6 mg · L'
[0015] 所述的一種納塔櫟組織培養(yǎng)方法，其特征在于所述的MS培養(yǎng)基是由大量元素、微 量元素、鐵鹽、有機(jī)成分組成； 所述的大量元素為：（1)硝酸鉀KNO3, 1900 mg · L' (2)硝酸銨NH4NO3, 1650 mg · ΙΛ ⑶磷酸二氫鉀 KH2PO4, 170 mg · ΙΛ (4)硫酸鎂 MgSO4 · 7Η20, 370 mg · ΙΛ (5)氯化鈣 CaCl2 · H2O, 440 mg · L S 所述的微量元素為：（1)碘化鉀KI，0.83 mg ·ΙΛ (2)硼酸H3BO3, 6.2 mg ·ΙΛ (3) 硫酸錳 MnSO4 · 4Η20, 22. 3 mg · ΙΛ (4)硫酸鋅 ZnSO4 · 7Η20, 8· 6 mg · Γ1 (5)鉬酸 鈉 Na2MoO4 · 2Η20, 0· 25 mg · Γ1 (6)硫酸銅 CuSO4 · 5Η20, 0· 025 mg · ΙΛ (7)氯化鈷 CoCl2 · 6Η20, 0· 025 mg · ΙΛ 所述的鐵鹽為：（I)乙二胺四乙酸二鈉 Na2 · EDTA，37. 3 mg · L_\ (2)硫酸亞鐵 FeSO4 · 7Η20, 27. 8 mg · Γ1; 所述的有機(jī)成分為：⑴肌醇C6H12062H20, 100 mg · Γ1 (2)甘氨酸NH2CH2 · C00H，2 mg · ΙΛ (3)鹽酸硫胺素 C12H17ClOS · 2HC1，0· I mg · Γ1 (4)鹽酸吡哆醇 C8H11O3N · HC1，0· 5 mg · Γ1 (5)煙酸 NC5H4 · C00H，0· 5 mg · Γ1。
[0016] 所述的一種納塔櫟組織培養(yǎng)方法，其特征在于所用1/4MS培養(yǎng)基為大量元素是MS 基本培養(yǎng)基的1/4,其余成分微量元素、鐵鹽、有機(jī)成分同MS基本培養(yǎng)基。
[0017] 上述一種納塔櫟組織培養(yǎng)方法，能較好的保持母本的抗逆性和觀賞性，大大縮短 了育苗周期，4個(gè)月即可獲得生根苗木，有效提高了納塔櫟繁殖系數(shù)；與種子繁殖相比，組 織培養(yǎng)降低對(duì)進(jìn)口種子的依賴性，能有效降低苗木成本，節(jié)省開支；與體胚發(fā)生組織培養(yǎng)方 法相比，采用不定芽增殖并直接生根成苗的方法，大大降低了母本發(fā)生變異的風(fēng)險(xiǎn)，能更好 的保持母本的抗逆性和觀賞性；本發(fā)明提供的組織培養(yǎng)方法大大縮短了育苗周期，有效提 高了納塔櫟繁殖系數(shù)，為納塔櫟苗木的產(chǎn)業(yè)化提供一種新的方法。
[0018] 本發(fā)明中涉及的百分含量除另有說(shuō)明的外，均為重量百分含量。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0020] 實(shí)施例1 : 納塔櫟組織培養(yǎng)方法包括以下步驟： 1) 外植體的選?。和庵搀w采自中國(guó)林科院亞林所抗逆生理生態(tài)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)培養(yǎng)的植株； 2) 外植體消毒：取帶芽莖段作為外植體，外植體經(jīng)自來(lái)水沖洗12小時(shí)后，再以75%的 酒精消毒30秒，然后升汞浸泡4分鐘，然后以無(wú)菌水沖洗4次，置于無(wú)菌玻璃瓶備用；若是 大田采集的外植體，則加入1-2滴吐溫80,以加強(qiáng)消毒劑的滲透； 3) 初代培養(yǎng)：將消毒外植體剪成Icm的帶芽莖段接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天，給予光照 3000 Lx，光周期16 hr/8hr，溫度25°C ±2°C;所述的初代培養(yǎng)基由WPM培養(yǎng)基+6-芐基腺 嘌呤I. I mg/L組成；或