一種基于超聲破碎的食用菌液體菌種制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食用菌培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于超聲破碎的食用菌液體菌種制作方法。
【背景技術(shù)】
[0002]食用菌是一類富有營(yíng)養(yǎng)與藥用價(jià)值的大型真菌，它主要利用農(nóng)業(yè)、林業(yè)以及工業(yè)生產(chǎn)中所產(chǎn)生的下腳料如稻草、玉米芯、棉子殼、木肩等可再生廢棄物作為原料進(jìn)行生產(chǎn)，轉(zhuǎn)廢為寶，生產(chǎn)的各種菇類可供人類食用和藥用。由于這些原材料均屬可再生資源，因此食用菌產(chǎn)業(yè)具有可持續(xù)發(fā)展的特點(diǎn)，與此同時(shí)這些廢棄物的利用還可減少其對(duì)環(huán)境的破壞作用，可以說(shuō)食用菌是地球生態(tài)循環(huán)的關(guān)鍵組成部分。目前，食用菌生產(chǎn)在我國(guó)正快速發(fā)展，已成為我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要組成部分，我國(guó)也因此成為世界最重要的食用菌生產(chǎn)國(guó)。
[0003]目前食用菌生產(chǎn)主要采用代料栽培模式，通常采用代料基質(zhì)培養(yǎng)的固體菌種作為接種物，但固體菌種具有生產(chǎn)周期長(zhǎng)、菌齡不一致、接種勞動(dòng)強(qiáng)度大以及不利于機(jī)械化接種等缺點(diǎn)。與固體菌種相比，液體菌種具有生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)自動(dòng)化水平高、菌齡均一、萌發(fā)吃料快等優(yōu)點(diǎn)，因此，食用菌液體菌種用于食用菌栽培的前景十分看好，是今后發(fā)展的必然趨勢(shì)，近年來(lái)液體菌種開(kāi)始應(yīng)用于少數(shù)菇類的生產(chǎn)正是這一趨勢(shì)的體現(xiàn)，取得了顯著的效益。此外，食用菌液體深層發(fā)酵開(kāi)始應(yīng)用于多糖、酶等活性產(chǎn)物生產(chǎn)，有可能成為食用菌生產(chǎn)新方法，其過(guò)程也離不開(kāi)液體菌種的制備。
[0004]食用菌液體菌種制備通常先將菌種活化，再轉(zhuǎn)至平板培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)好后用打孔器于培養(yǎng)菌落近邊緣打孔，挑取瓊脂塊進(jìn)行液體培養(yǎng)，作為液體菌種，或以此作為菌種培養(yǎng)二級(jí)種，以擴(kuò)大菌種量，視菌種需要量可進(jìn)一步搖瓶或發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)。由于食用菌液體培養(yǎng)時(shí)主要以菌絲球形式生長(zhǎng)，直接將液體菌種作為接種種子時(shí)生長(zhǎng)點(diǎn)極少，致使生長(zhǎng)速度慢或需要加大接種量，此外，原始液體菌種接種時(shí)難于準(zhǔn)確控制接種量，以及由于菌絲球過(guò)大不利于機(jī)械化接種的實(shí)現(xiàn)。為提高液體菌種生長(zhǎng)點(diǎn)、便于接種以及準(zhǔn)確控制接種量，少數(shù)人采用研磨或機(jī)械均質(zhì)法將原始液體菌種均質(zhì)處理后再用于接種，但這兩種方法均易導(dǎo)致菌種污染，且均質(zhì)程度不夠高，因此，開(kāi)發(fā)更有效的食用菌液體菌種均質(zhì)方法具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種利用超聲波破碎技術(shù)獲得食用菌液體菌種的方法，以提高液體菌種的使用效率和便于自動(dòng)化接種。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
本發(fā)明一種基于超聲破碎的食用菌液體菌種制作方法，包括以下步驟:
(O活化保藏菌種；
(2)活化菌種轉(zhuǎn)至馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基(PDA)培養(yǎng)；
(3)待長(zhǎng)出菌落后用打孔器于菌落近邊緣打孔； (4)挑取打孔后瓊脂塊菌種至裝有液體培養(yǎng)基的搖瓶培養(yǎng)；
(5)培養(yǎng)后利用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎，得到含大量菌絲片段的均質(zhì)化液體菌種，數(shù)量級(jí)擴(kuò)增接種物的生長(zhǎng)點(diǎn)，作為液體深層發(fā)酵或制作原種和栽培種的接種物以及代料栽培的接種物。
[0007]其中，所述步驟(5)的均質(zhì)化液體菌種，可以繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)后再次進(jìn)行超聲波破碎，得到更大量的菌種。
[0008]具體如下:
(1)保藏的食用菌母種接種至新鮮斜面，25-27?培養(yǎng)活化7-10d ;
(2)活化菌種接種至PDA平板，25-27°C培養(yǎng)5_10d ；
(3)無(wú)菌條件下，用直徑0.5-1 cm的打孔器于平板中菌落近邊緣打孔；
(4)挑取打孔瓊脂塊菌種至50mL液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，300C、160 rev/min培養(yǎng)5-10 d ;液體培養(yǎng)基配方為:葡萄糖35 g，蛋白胨3.5 g，KH2PO4 I g，MgSO4 0.5g，維生^B1 0.01 g，1000 mL 去離子水;
(5 )培養(yǎng)后進(jìn)行超聲波破碎，超聲探頭消毒后直接置于搖瓶液體培養(yǎng)物中，超聲破碎條件為:連續(xù)間斷超聲6次、每次10 S，或超聲3次、每次20 S，共I min，功率為250 W，得到含大量菌絲片段的均質(zhì)化液體菌種；
(6)液體菌種接種至裝有液體培養(yǎng)基的搖瓶，接種量為2%(v/v)，溫度30°C，160 rev/min培養(yǎng)3-7 d。培養(yǎng)時(shí)間視菌種和培養(yǎng)目的而定，如作為液體菌種，則培養(yǎng)時(shí)間宜短，這時(shí)菌種活性高；如以收集菌絲體及活性產(chǎn)物為目的，則培養(yǎng)時(shí)間可較長(zhǎng)，以充分發(fā)酵。
[0009](7)培養(yǎng)結(jié)束后收集菌絲體和發(fā)酵液，用于活性物質(zhì)提??；如以液體菌種培養(yǎng)為目的(培養(yǎng)時(shí)間較短)，培養(yǎng)結(jié)束后超聲破碎(也可以再次用于以擴(kuò)大培養(yǎng)液體菌種為目的)，得到的菌種作為液體發(fā)酵菌種或作為大量制備原種、栽培種的接種物或直接作為代料栽培的接種物。本發(fā)明的有益效果是:液體深層發(fā)酵時(shí)，與原始液體菌種相比，采用超聲破碎液體菌種作為接種物時(shí)，發(fā)酵周期縮短，生物量和多糖等活性產(chǎn)物產(chǎn)量高，且還可顯著降低菌種使用量；此外，發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程可形成均一性菌絲球，有利于過(guò)程控制和細(xì)胞生理研宄。食用菌代料栽培時(shí)，采用超聲破碎菌種作為栽培接種物時(shí)，最大優(yōu)勢(shì)在于可顯著減少菌種用量、縮短生產(chǎn)周期、提高菌種使用效率以及便于機(jī)械化、自動(dòng)化接種的實(shí)現(xiàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0010]本發(fā)明提供了一種食用菌液體菌種制作方法，下面以實(shí)施例來(lái)描述本發(fā)明的使用方法，但這些實(shí)施例僅是規(guī)范性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。此外，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換仍在本發(fā)明保護(hù)范圍。
[0011]實(shí)施例1
靈芝液體菌種制作及搖瓶發(fā)酵
1、靈芝試管母種接種至新鮮斜面，26°C培養(yǎng)活化7-10d ;
2、活化菌種接種至PDA平板，26°C培養(yǎng)7-10d ；
3、超凈工作臺(tái)或無(wú)菌條件下，用直徑Icm的打孔器于平板中靈芝菌落近邊緣打孔；
4、挑取打孔瓊脂塊菌種5塊至50mL液體培養(yǎng)基(250 mL搖瓶)進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:30°C、160 rev/min培養(yǎng)10 d ;其中，液體培養(yǎng)基配方為:葡萄糖35 g，蛋白胨3.5 g，KH2PO4 I g，MgSO4 0.5g，維生素 B1 0.01 g，1000 mL 去離子水；
5、采用超聲波細(xì)胞儀破碎液體培養(yǎng)物，超聲探頭消毒后直接置于搖瓶液體培養(yǎng)物中，超聲條件為250 W、連續(xù)超聲20 S、共3次，合計(jì)I min，獲得含有大量菌絲片段的均質(zhì)化液體菌種；
6、接種至裝有50mL液體培養(yǎng)基的250 mL搖瓶，接種量為2% (v/v), 30°C ,160 rev/min搖床振蕩培養(yǎng)7 d ；
7、發(fā)酵結(jié)束后收集菌絲體和發(fā)酵液，生物量、胞外多糖和胞內(nèi)三萜酸分別達(dá)到16.7g/L、2.4 g/L, 213 mg/L，而以原始液體菌種為接種物的發(fā)酵[接種量為10% (v/v)]分別僅為10.4 g/L、l.6 g/L和162 mg/L，提高了 60.6%、50%和31.5%，而菌種使用量?jī)H為后者的20%。
[0012]實(shí)施例2
猴頭菇液體菌種制作及多糖搖瓶發(fā)酵
1、猴頭菇試管母種接種至新鮮斜面，25°C培養(yǎng)活化7-10d ;
2、活化猴頭菇菌種接種至PDA平板，25°C培養(yǎng)10d ；
3、超凈工作臺(tái)或無(wú)菌條件下用直徑0.5 cm打孔器于菌落近邊緣打孔；
4、挑取打孔瓊脂塊菌種5塊至50mL液體培養(yǎng)基(250 mL搖瓶)進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:30°C、160 rev/min培養(yǎng)10 d ;其中，液體培養(yǎng)基配方為:葡萄糖35 g，蛋白胨3.5 g，KH2PO4 I g，MgSO4 0.5g，維生素 B1 0.01 g，1000 mL 去離子水；
5、采用超聲波細(xì)胞儀破碎液體培養(yǎng)物，超聲探頭消毒后直接置于搖瓶液體培養(yǎng)物中，超聲條件為250 W、連續(xù)超聲10 S、共6次，合計(jì)I min，獲得含有大量菌絲片段的均質(zhì)化液體菌種，接種至裝有50 mL液體培養(yǎng)基的250 mL搖瓶，接種量為2% (v/v)，30°C、160 rev/min搖床振蕩培養(yǎng)7 d ；
6、發(fā)酵結(jié)束后收集菌絲體和發(fā)酵液，生物量和胞外多糖分別達(dá)到13.1 g/L和1.7 g/L,而以原始液體