一種鐵皮石斛藥用原球莖大型生物反應(yīng)器克隆生產(chǎn)工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開一種鐵皮石斛藥用原球莖大型生物反應(yīng)器克隆生產(chǎn)工藝，屬于生物工 程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kmuraet Migo)是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，味 甘，性微寒，具有生津養(yǎng)胃、滋陰清熱、潤肺益腎、明目強腰等功效。唐代開元年間的《道藏》 把："鐵皮石斛、天山雪蓮、三兩重的人參、百二十年的首烏、花甲之茯苓、灰蓉、深山靈芝、海 底珍珠、冬蟲夏草"并稱為中華九大仙草。根據(jù)國家藥典記載，其主要藥效成份為石斛多糖 和石斛堿。
[0003] 由于鐵皮石斛可觀的經(jīng)濟效益，畝產(chǎn)收益可達10萬元以上，這也吸引了越來越多 的種植戶投身于鐵皮石斛的種植行業(yè)中來，就具體種植面積而言，全國集約化種植（大棚 內(nèi)種植）面積已超10萬畝。而全國中藥材種植用地目前已經(jīng)高達驚人的12000萬畝（占到 全國糧食總種植面積的1/10)，這也導致了更多的糧食種植用地進一步被占用、糧食減產(chǎn)、 糧食儲量得不到保障、糧食價格不穩(wěn)定等關(guān)乎民生的危情出現(xiàn)。
[0004] 另外由于鐵皮石斛種植周期長，一般需要三到四年時間才可以采收，一些不法商 家以其他生長較快且藥效一般的石斛品種仿冒鐵皮石斛進行高價售賣，欺騙消費者，擾亂 了市場。此外，在鐵皮石斛的種植過程中由于大量使用農(nóng)藥、激素、化肥和未經(jīng)凈化處理過 的水源等，導致鐵皮石斛受到重金屬、農(nóng)藥、激素等的污染，這不但影響了鐵皮石斛品質(zhì)，也 會隨患者食用鐵皮石斛后進入體內(nèi)，導致各種慢性疾病的發(fā)生。
[0005] 鐵皮石斛藥用原球莖是由鐵皮石斛果莢中的種胚微粒經(jīng)液體克隆形成球莖原胚 體，該階段，可通過營養(yǎng)調(diào)節(jié)和特殊的培養(yǎng)條誘導使原球莖富集了大量的初生和次生代謝 產(chǎn)物，其中石斛堿、毛蘭素和多糖的含量均為其整個生長過程中最高的階段。
[0006] 鐵皮石斛原球莖已被證實與原藥材鐵皮楓斗和鮮條等具有同等的藥用價值，衛(wèi)計 委也擬將鐵皮石斛原球莖列入新食品原料目錄中。然而，由于原球莖生長的特殊性，如球莖 個體大，是單一細胞團的1600倍；對通氣量、光照強度和對溫度敏感；對培養(yǎng)基的營養(yǎng)成份 要求較高；生長周期長等。上述因素極大地限制了鐵皮石斛原球莖的大規(guī)模工廠化生產(chǎn)，影 響了鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。本發(fā)明基于上述問題的不斷研宄和探素，成功開發(fā)出應(yīng)用 于原球莖工廠化生產(chǎn)的大型生物反應(yīng)器和生產(chǎn)工藝。
[0007] 本發(fā)明的實際應(yīng)用可以有效地解決上述問題，應(yīng)用150升植物細胞生物反應(yīng)的克 隆生產(chǎn)工藝，可實現(xiàn)年產(chǎn)量達1000公斤/罐的藥用原球莖，這相當于傳統(tǒng)種植10畝地的年 平均產(chǎn)量，且單批次生產(chǎn)周期僅為兩個月，是傳統(tǒng)種植的1/12。本發(fā)明專利的生產(chǎn)過程是隔 離式無菌培養(yǎng)，所收獲的原球莖均無激素殘留、農(nóng)藥殘留、重金屬污染、有害元素污染。與傳 統(tǒng)原球球莖組培相比，本發(fā)明具有生產(chǎn)規(guī)模大，生產(chǎn)成本低，石斛藥效成份表達穩(wěn)定、表達 量高，克隆生產(chǎn)全程可控，產(chǎn)品安全系數(shù)高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的任務(wù)是在于提供一種鐵皮石斛藥用原球莖大型生物反應(yīng)器克隆生產(chǎn)工 藝，旨在保證原球莖藥用價值的同時實現(xiàn)大規(guī)模工廠化生產(chǎn)，包括以下步驟。
[0009] 1)選用人工種植的鐵皮石斛成熟果莢，果莢飽滿，青綠或綠紫色，采收于十月至 十一月期間，先用干燥紙巾包裹好，放入存有干燥劑的帶蓋玻璃瓶，低溫4°C下處理3天后， 取出用手術(shù)刀片將果莢的多余部份切除，只留1~2cm長的果柄，稱重并記錄。果莢先用酒 精棉球擦拭表面，于5~10%次氯酸鈉處理10~20min，無菌水沖洗3~5次，然后浸入70~75%酒 精中30s~lmin，無菌水沖洗3~5次，置于接種盤中切開果莢底部，均勻地播入裝有種子液體 培養(yǎng)基的通氣培養(yǎng)瓶中。
[0010] 其中種子液體培養(yǎng)基的配方為1/2改良MS、4%蔗糖、15%馬鈴薯提取汁、pH5. 5,其 中1/2改良MS的配方為：銷酸銨和氯化鈣減半，其他不變。培養(yǎng)條件為光照2600LUX，溫度 25°C，通氣lm3/min，培養(yǎng)45天后即可準備接入大型生物反應(yīng)器。
[0011] 2)種胚微粒誘導萌發(fā)，得到原球莖種子，配制克隆生產(chǎn)培養(yǎng)基和補料培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入 150升植物細胞反應(yīng)器中，在位滅菌后將原球莖種子接入，接種量為：15g/L，先后進行暗培 養(yǎng)和光照培養(yǎng)，完成培養(yǎng)收集原球莖后進行稱重換算增殖系數(shù)。
[0012] 其中，原球莖克隆生產(chǎn)培養(yǎng)基的配方為：改良MS、2%蔗糖、1%葡萄糖、15%馬鈴薯 提取汁、NAA lmg/L，補料本方為：克隆培養(yǎng)基濃縮10倍；接種量為：15g/L ;暗培養(yǎng)的參數(shù) 為：溫度25°C、通氣2m3/min、轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/min、pH5. 5、周期15天；光照培養(yǎng)的參數(shù)為溫度 27°C、通氣4m3/min、轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/min、pH5. 5、周期25天，每隔7天進行一次補料。
[0013] 3)每隔10天對罐內(nèi)原球莖進行取樣檢測，檢測項目與檢測方法根據(jù)藥典標準執(zhí) 行。并根據(jù)各成份的含量進行添加相應(yīng)的補料進行調(diào)控，以使原球莖的有效成份達到最高 標準。
[0014] 4)完成培養(yǎng)后，收集原球莖，瀝干水分，稱重記錄，計算增殖倍數(shù)。
[0015] 與傳統(tǒng)原球球莖組培相比，本發(fā)明具有生產(chǎn)規(guī)模大，生產(chǎn)成本低，增殖倍數(shù)可達 40-60倍，石斛藥效成份表達穩(wěn)定、表達量高，克隆生產(chǎn)全程可控，產(chǎn)品安全系數(shù)高等優(yōu)。
【具體實施方式】
[0016] 下面將結(jié)合本發(fā)明的具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案進行清晰、完整地描述。顯 然所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例，基于本發(fā)明中的實 施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下，所獲得的所有其他實施例，都屬 于本發(fā)明保護范圍。
[0017] 實施例一 1) 選用人工種植的鐵皮石斛成熟果莢，果莢飽滿，青綠或綠紫色，采收于10月15日，先 用干燥紙巾包裹好，放入存有干燥劑的帶蓋玻璃瓶，低溫4°C下處理3天后，用手術(shù)刀片將 果莢的多余部份切除，只留1.5cm長的果柄，稱重并記錄，得1.63g; 2) 將處理好的果莢移入已經(jīng)滅過菌的超凈工作臺內(nèi)，先用酒精棉球擦拭果莢表面，于 10%次氯酸鈉處理l〇~20min，無菌水沖洗3次，然后浸入70%酒精中40smin，無菌水沖洗3 次，置于接種盤中切開果莢底部，均勻地播入裝有種子液體培養(yǎng)基的通氣培養(yǎng)瓶中，播完種 的果莢取出，稱重并記錄，得〇. 93g，計算播入種胚微粒的克數(shù)為0. 7g ; 3) 其中種子液體培養(yǎng)基的配方為1/2改良MS、4%蔗糖、15%馬鈴薯提取汁、pH5. 5,其中 1/2改良MS的配方為：銷酸銨和氯化鈣減半，其他不變，而1/2改良MS為大量元素再減半， 其他元素不變； 4) 培養(yǎng)條件為光照2600Lux，溫度25°C，通氣lm3/min，培養(yǎng)45天后取出小原球莖，外 觀記錄為：黃綠色，形態(tài)飽滿，錐形球狀，球莖較大；瀝干水份后，稱重得81. 23g，計算種胚 的增殖倍數(shù)為115. 7。收集共計1500g的小原球莖，用于大型生物反應(yīng)器的克隆生產(chǎn)。 [0018] 實施例二 1) 配制原球莖克隆生產(chǎn)培養(yǎng)基100L，配方為改良MS、2%蔗糖、1%葡萄糖、15%馬鈴薯提 取汁、NAA lmg/L，其中改良MS為銷酸銨和氯化鈣減半，其他元素不變。將培養(yǎng)基倒入發(fā)酵 罐，執(zhí)行在位滅菌121°C，40min ; 2) 配制補料培養(yǎng)基20L，分裝四瓶5升的呼吸瓶，121°C，滅菌30min，補料單獨滅菌后， 與自動補料泵和罐頂補料接口連接。補料配方為克隆生產(chǎn)培養(yǎng)基濃縮10倍； 3) 稱取上述準備好的1500g原球莖種子，即接種量為15g/L ; 4) 在超凈工作臺中將原球莖轉(zhuǎn)入接種瓶中，再將接種瓶安裝至接種口上，進行接口處 滅菌，完成滅菌后打開上下兩個閥門進行自動接種，然后關(guān)閉下閥門； 5) 開始執(zhí)行發(fā)酵程序，暗培養(yǎng)的參數(shù)為：溫度25°C、通氣2m3/min、轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/min、 pH5. 5、周期15天；光照培養(yǎng)的參數(shù)為溫度27°C、通氣4m3/min、轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/min、pH5. 5、周 期25天；每隔7天進行一次自動補料，補料量為5L ; 6) 在培養(yǎng)期間，每隔十天對罐內(nèi)原球莖進行取樣檢測，檢測項目按藥典標準執(zhí)行，檢測 結(jié)果如下表：
【主權(quán)項】
1. 一種鐵皮石斛藥用原球莖大型生物反應(yīng)器克隆生產(chǎn)工藝，步驟包括：種胚微粒誘導 萌發(fā)，得到原球莖種子，配制克隆生產(chǎn)培養(yǎng)基和補料培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入150升植物細胞專用反應(yīng) 器中，在位滅菌后將原球莖種子接入，先后進行暗培養(yǎng)和光照培養(yǎng)，完成培養(yǎng)收集原球莖后 進行稱重換算增殖系數(shù)并按藥典標準進行檢測。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鐵皮石斛藥用原球莖大型生物反應(yīng)器克隆生產(chǎn)工藝，其 特征在于種胚微粒取自鐵皮石斛的果莢，果莢先用酒精棉球擦拭表面，于5~10%次氯酸鈉 處理10~20min，無菌水沖洗3~5次，然后浸入70~75%酒精中30s~lmin，無菌水沖洗3~5次， 置于接種盤中切開果莢底部，均勻地播入裝有種子液體培養(yǎng)基的通氣培養(yǎng)瓶中。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種鐵皮石斛藥用原球莖大型生物反應(yīng)器克隆生產(chǎn)工藝，其 特征在于種子液體培養(yǎng)基的配方為1/2改良MS、4%蔗糖、15%馬鈴薯提取汁、pH5. 5,其中 1/2改良MS的配方為：銷酸銨和氯化鈣減半，其他不變。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鐵皮石斛藥用原球莖大型生物反應(yīng)器克隆生產(chǎn)工藝，其 特征在于種胚微粒在種子液體培養(yǎng)中培養(yǎng)條件為光照2600Lux，溫度25°C，通氣lm 3/min，培 養(yǎng)45天后接入大型生物反應(yīng)器。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鐵皮石斛藥用原球莖大型生物反應(yīng)器克隆生產(chǎn)工藝，其 特征在于原球莖克隆生產(chǎn)培養(yǎng)基的配方為：改良MS、2%蔗糖、1%葡萄糖、15%馬鈴薯提取汁， 補料本方為：克隆培養(yǎng)基濃縮10倍。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鐵皮石斛藥用原球莖大型生物反應(yīng)器克隆生產(chǎn)工藝，其 特征在于： A、 接種量為：15g/L; B、 暗培養(yǎng)的參數(shù)為：溫度25°C、通氣2m3/min、轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/min、pH5. 5、周期15天； C、 光照培養(yǎng)的參數(shù)為溫度27°C、通氣4m3/min、轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/min、pH5. 5、周期25天，每 隔7天進行一次補料。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鐵皮石斛藥用原球莖大型生物反應(yīng)器克隆生產(chǎn)工藝，其 特征在于鐵皮石斛原球莖收獲后經(jīng)稱重，換算得增殖系數(shù)為60-80倍。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鐵皮石斛藥用原球莖大型生物反應(yīng)器克隆生產(chǎn)工藝，其 特征在于收獲的鐵皮石斛藥用原球莖的質(zhì)量標準如下：石斛多糖>45%，甘露糖在13~38%， 灰份〈4. 5%，浸出物>16%。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鐵皮石斛藥用原球莖大型生物反應(yīng)器克隆生產(chǎn)工藝，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，所述的大型生物反應(yīng)器為150升植物細胞專用反應(yīng)器，具有光照、控溫、補料、攪拌、無菌取樣、無菌出料、進氣過濾和遠程控制功能；所述的原球莖克隆生產(chǎn)工藝，步驟包括：種胚微粒誘導萌發(fā)，將原球莖種子接入150升植物細胞專用反應(yīng)器中，經(jīng)暗培養(yǎng)階段、光照培養(yǎng)階段和階段補料，40天后收集原球莖。測定石斛多糖含量為48%，甘露糖33%，灰分為4.5%，浸出物16.3%。與傳統(tǒng)原球球莖組培相比，本發(fā)明具有生產(chǎn)規(guī)模大，生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)過程中無污染，增殖倍數(shù)可達40-60倍，石斛藥效成份表達穩(wěn)定、表達量高，克隆生產(chǎn)全程可控，產(chǎn)品安全系數(shù)高。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號】CN104855293
【申請?zhí)枴緾N201510326112
【發(fā)明人】林潘第
【申請人】泉州正和堂生物科技有限公司
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2015年6月15日