一種簡易高效的牡丹試管苗生根方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種簡易高效的牡丹試管苗生根方法，屬于組織培養(yǎng)植物再生技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 牡丹（Paeonia sect. Moutan)是毛茛科茍藥屬花丼，是我國特有的名貴觀賞、藥用 和油用植物。長期以來，牡丹的繁殖以分株、嫁接為主，繁殖系數(shù)低、周期長，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足 商品苗規(guī)?；?、規(guī)范化生產(chǎn)的需要，是阻礙牡丹成為大宗商品花丼的主要因素。
[0003] 植物組織培養(yǎng)具有微型繁殖周期短，繁殖系數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)，已是公認(rèn)的植物快速繁 殖的有效途徑。生根培養(yǎng)是組織培養(yǎng)的重要階段，現(xiàn)有的牡丹組培苗生根方法為"三部生根 法"。"三步生根法"包括三個(gè)階段，根據(jù)不同生根階段的不同要求的更換三次培養(yǎng)基。第一 步，無激素培養(yǎng)基培養(yǎng)；第二步，培養(yǎng)基附加 IBA誘導(dǎo)根原基發(fā)生；第三步，無激素且附加活 性炭培養(yǎng)基促進(jìn)根原基伸長。該方法雖然提高了生根率（50-60%;)，減輕了試管苗基部愈 傷組織的形成，但操作復(fù)雜，耗費(fèi)大量人力物力，極大增加了生產(chǎn)成本。同時(shí)生根周期長（5 個(gè)月以上）不利于生產(chǎn)過程的成本控制?？傊F(xiàn)有技術(shù)沒有使牡丹組培苗的生根問題得 到很好的解決，生根難仍然制約著牡丹組織培養(yǎng)技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種簡易高效的牡丹試管苗生根方法，通過在生根培養(yǎng)基中 添加維生素 B2以及對(duì)培養(yǎng)過程中光照條件的控制操作，以"一步生根法"實(shí)現(xiàn)了"三步生根 法"的生根效果，并縮短了生根周期。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] -種牡丹試管苗生根方法，通過在生根培養(yǎng)基中添加 IBA、維生素 B2,采取先暗培 養(yǎng)再光培養(yǎng)的生根方式，可實(shí)現(xiàn)牡丹試管苗高效"一步生根"的目的。
[0007] 在本發(fā)明所述的生根方法中，所述維生素 B2的添加量為1.0-5. Omg/L，優(yōu)選 I. 〇-3. 0mg/L〇
[0008] 在本發(fā)明所述的生根方法中，所述生根培養(yǎng)基為以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng) 基，附加 IBA(吲哚丁酸）L 0-3. Omg/L，腐胺 L 0-5. Omg/L，維生素 B21. 0-5. Omg/L，蔗糖 30-40g/L，瓊脂6. 0-7. 0g/L，PH = 5. 8-6. 0 ;優(yōu)選培養(yǎng)基為：以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基， 其中CaCl2添加量加倍，且添加 IBA (吲哚丁酸）I. 0mg/L、腐胺I. 0mg/L、維生素 B21. 0mg/L、 鹿糖 30g/L，瓊脂 6. 0g/L，PH = 5. 8 ;
[0009] 所述MS培養(yǎng)基為本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的常用組織培養(yǎng)基；所述1/2MS培養(yǎng)基是 指以MS培養(yǎng)基為基本，其中無機(jī)鹽添加量減半，且0&(：1 2添加量加倍的培養(yǎng)基。
[0010] 在本發(fā)明所述的生根方法中，所述暗培養(yǎng)條件為：先于2-4°C暗培養(yǎng)8天，再轉(zhuǎn)入 18-20 °C 暗培養(yǎng) 22-23 天。
[0011] 在本發(fā)明所述的生根方法中，所述光培養(yǎng)條件為：每天光照12-14小時(shí)，光強(qiáng) 30-40 ymol πΓ2^1。其中光照的光源可采用熒光燈或LED燈。
[0012] 作為本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，所述的牡丹試管苗生根方法，具體包括如下步驟：
[0013] 1)培養(yǎng)基的配制：以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加 IBA(吲哚丁 酸）L 0-3. Omg/L，腐胺 L 0-5. Omg/L，維生素 B21. 0-5. Omg/L，蔗糖 30-40g/L，瓊脂 6. 0-7. Og/L，PH = 5. 8-6. 0。
[0014] 2)組織培養(yǎng)：先將試管苗置于2-4°C暗培養(yǎng)8天；然后轉(zhuǎn)入18-20 °C暗培養(yǎng) 22-23天，以誘導(dǎo)根源基發(fā)生；最后將試管苗轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)20天，每天光照12-14小時(shí)，光強(qiáng) 30-40 μ mol m 2s 1O
[0015] 在實(shí)施本發(fā)明所述的生根方法之前，先切除牡丹試管苗上多余的葉片，僅保留展 開的1-2片葉片，再進(jìn)行組織培養(yǎng)。
[0016] 本發(fā)明的有益效果：
[0017] 1)本發(fā)明通過生根培養(yǎng)基中添加維生素 B2以及對(duì)培養(yǎng)過程中光照條件的控制， 可一步法實(shí)現(xiàn)生根，中間不需更換培養(yǎng)基，大大簡化了生根流程，有助于降低生產(chǎn)成本；
[0018] 2)本發(fā)明所述的"一步生根"使牡丹組培苗生根率達(dá)到70%，明顯高于現(xiàn)有技術(shù) "三步生根法"的生根率水平（50-60% )，生根率的提高有助于提高生產(chǎn)效率；
[0019] 3)采用本發(fā)明所述的"一步生根"法，在生根過程中，組培苗基部幾乎不產(chǎn)生愈傷 組織，有利于組培苗的移栽成活；
[0020] 4)采用本發(fā)明所述的"一步生根"法，整個(gè)生根周期為50天，遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于現(xiàn)有生根法 5-6個(gè)月的培養(yǎng)周期，極大縮短了培養(yǎng)周期，有助于控制生產(chǎn)成本。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0022] 實(shí)施例1
[0023] 1、材料
[0024] 選用繼代培養(yǎng)三次得到的'正午'牡丹的組培苗。
[0025] 2、培養(yǎng)
[0026] 1)培養(yǎng)基的配制：以1/2MS (CaCl2加倍）培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加 IBA (吲哚丁 酸）I. 0mg/L、腐胺 I. 0mg/L、維生素 B21. 0mg/L ;鹿糖 30g/L，瓊脂 6. 0g/L，PH = 5. 8 ;
[0027] 2)組織培養(yǎng)：先切除牡丹試管苗上多余的葉片，僅保留1-2片展開的葉片，將試管 苗置于4°C暗培養(yǎng)8天，轉(zhuǎn)入19 ± 1°C暗培養(yǎng)22天以誘導(dǎo)根源基發(fā)生，最后將試管苗在熒光 燈（TLD 36W/33Philips)光照下培養(yǎng)20天；其中，每天光照12小時(shí)，光強(qiáng)30μηιο1 nT2sd。
[0028] 實(shí)施例2-3
[0029] 采用實(shí)施例1的方法進(jìn)行牡丹試管苗生根，區(qū)別在于，維生素 B2添加量分別為 3. 0mg/L、5. 0mg/L〇
[0030] 對(duì)比例1-3
[0031] 采用實(shí)施例1的方法進(jìn)行牡丹試管苗生根，區(qū)別在于，維生素 B2添加量為10.0 mg/ L、15. 0mg/L、0mg/L〇
[0032] 實(shí)施例4
[0033] 采用實(shí)施例1的方法進(jìn)行牡丹試管苗生根，區(qū)別在于，根形成階段光照強(qiáng)度為 40 μ mol m 2S 1O
[0034] 對(duì)比例4-6
[0035] 采用實(shí)施例4的方法進(jìn)行牡丹試管苗生根，區(qū)別在于，根形成階段光照強(qiáng)度為 Oymol m 2S \20 μ mol m 2S \50 μ mol m 2S 1。
[0036] 對(duì)比例 7-10
[0037] 采用實(shí)施例1的方法進(jìn)行牡丹試管苗生根，區(qū)別在于，根形成階段光照強(qiáng)度為 20 μ mol m 2S \ 根誘導(dǎo)階段光照強(qiáng)度為 20 μ mol m 2s 1JOymol m 2s 1JOymol m 2S \ 50 μ mol m 2S、
[0038] 對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0039] 將實(shí)施例1-5及對(duì)比例1-11的生根情況統(tǒng)計(jì)，包括生根率、生根條數(shù)、根長等指 標(biāo)，并評(píng)價(jià)試管苗基部愈傷組織等級(jí)，結(jié)果如下表：
[0040] 表1試管苗生根結(jié)果統(tǒng)計(jì)
[0043] 注：表中數(shù)據(jù)為均值土標(biāo)準(zhǔn)差，字母表示不同處理間多重比較的結(jié)果，不同小寫 字母表示P = 0. 05差異顯著水平。
[0044] 愈傷等級(jí)：+愈傷組織極少；++基部膨大，有輕微愈傷組織。+++基部嚴(yán)重愈傷化， 根從愈傷組織發(fā)出。
[0045] 由表1可見，1)在根誘導(dǎo)暗培養(yǎng)、根形成光照強(qiáng)度30μπι〇1 Hf2iT1條件下，添加不 同量的維生素 B2處理的組培苗（實(shí)施例1-3、對(duì)比例1-2)的生根率、平均根數(shù)、平均根長皆 顯著高于空白對(duì)照組（對(duì)比例3)。其中，維生素 B2添加量在I. 0-5. Omg/L范圍內(nèi)處理效果 最佳（實(shí)施例1-3)，生根率71. 0-74. 2 %，平均根數(shù)3. 1-3. 3,平均根長3. 5-3. 7cm，且試管 苗基部愈傷組織極少。
[0046] 2)培養(yǎng)基中添加維生素 B2,根誘導(dǎo)暗培養(yǎng)后，牡丹試管苗基部誘導(dǎo)得到根原基。 當(dāng)根形成階段最佳光照強(qiáng)度為30-40 μ mol Hf2iT1范圍內(nèi)，既可以保證較高的生根率，又可 避免刺激試管苗基部愈傷組織的形成。
[0047] 3)維生素 Β2的添加與根誘導(dǎo)階段光照培養(yǎng)相結(jié)合可導(dǎo)致牡丹試管苗生根率為0。 因此，在培養(yǎng)基中添加維生素 Β2的同時(shí)，根誘導(dǎo)階段應(yīng)采用暗培養(yǎng)（光照強(qiáng)度為0)才有利 于牡丹試管苗生根。
[0048] 綜上，本發(fā)明通過在生根培養(yǎng)基中添加 IBA以及適宜濃度維生素 Β2,采取先暗培 養(yǎng)（誘導(dǎo)根原基）再光培養(yǎng)（促進(jìn)根原基伸長生長）的生根方式，可實(shí)現(xiàn)牡丹試管苗高效 "一步生根"的目的。
[0049] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種牡丹試管苗生根方法，其特征在于，在生根培養(yǎng)基中添加IBA和維生素B2,并采 取先暗培養(yǎng)再光培養(yǎng)的生根方式。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生根方法，其特征在于，所述維生素B2的添加量為 I. 〇-5. 0mg/L〇3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的生根方法，其特征在于，所述維生素B2的添加量為 I. 〇-3. 0mg/L〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生根方法，其特征在于，所述暗培養(yǎng)條件為：先于2-4°C暗培 養(yǎng)8天，再轉(zhuǎn)入18-20°C暗培養(yǎng)22-23天。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生根方法，其特征在于，所述光培養(yǎng)條件為：每天光照12-14 小時(shí)，光強(qiáng) 30-40 ymol m 2s 1O6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的生根方法，其特征在于，所述光照的光源采用熒光燈或LED 燈。7. 根據(jù)權(quán)利要求2、4或5任一所述的生根方法，其特征在于，所述生根培養(yǎng)基為 以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加IBAL0-3.Omg/L，腐胺I. 0-5.Omg/L，維生素B2 I. 0-5.Omg/L，蔗糖 30-40g/L，瓊脂 6. 0-7.Og/L，PH= 5. 8-6. 0。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生根方法，其特征在于，所述的牡丹試管苗生根方法，具體包 括如下步驟： 1) 培養(yǎng)基的配制：以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加IBA(吲哚丁酸）I. 0-3.Omg/ L，腐胺I. 0-5. 0mg/L，維生素B2I. 0-5. 0mg/L，蔗糖 30-40g/L，瓊脂 6. 0-7. 0g/L，PH= 5. 8~6. 0 ； 2) 組織培養(yǎng)：先將試管苗置于2-4°C暗培養(yǎng)8天；然后轉(zhuǎn)入18-20°C暗培養(yǎng)22-23天， 以誘導(dǎo)根源基發(fā)生；最后將試管苗轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)20天，每天光照12-14小時(shí)，光強(qiáng)30-40 y mol m 2s 1O9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的生根方法，其特征在于，先切除牡丹試管苗上多余的葉片，僅 保留展開的1-2片葉片，再進(jìn)行組織培養(yǎng)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種牡丹試管苗生根方法，在生根培養(yǎng)基中添加IBA和維生素B2，并采取先暗培養(yǎng)再光培養(yǎng)的生根方式。采用本發(fā)明所述的生根方法一步實(shí)現(xiàn)生根，中間不需更換培養(yǎng)基，簡化了生根流程，降低生產(chǎn)成本；生根率達(dá)到70％，有助于提高生產(chǎn)效率；在生根過程中，組培苗基部幾乎不產(chǎn)生愈傷組織，有利于組培苗的移栽成活；整個(gè)生根周期為50天，極大縮短了培養(yǎng)周期，有助于控制生產(chǎn)成本。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號(hào)】CN104920210
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510256388
【發(fā)明人】成仿云, 文書生, 鐘原
【申請(qǐng)人】北京林業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年9月23日
【申請(qǐng)日】2015年5月19日