一種表面帶茸毛植物組織培養(yǎng)時(shí)外植體消毒方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種表面帶茸毛植物組織培養(yǎng)時(shí)外植體消毒方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域 中的植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 虎舌紅屬于（Ardisia mamillata Hance)紫金?？疲∕yrsinaceae)紫金牛屬 (Ardisia)，是一種多年生常綠小灌木。虎舌紅因其通體覆蓋茸毛，內(nèi)藏大量污垢，給組織培 養(yǎng)時(shí)外植體的表面消毒造成很大的困難，往往導(dǎo)致消毒不徹底而污染率較高或者消毒過(guò)度 致使外植體生活力喪失，較難獲得無(wú)菌材料。所以，有效無(wú)菌材料的獲得是虎舌紅組織培養(yǎng) 的關(guān)鍵。
[0003] 常規(guī)的植物組織培養(yǎng)中外植體的消毒方法是先流水沖洗，再用酒精消毒30秒到1 分鐘，再用〇. 1%的生汞消毒幾分鐘，無(wú)菌水沖洗后最后進(jìn)行接種。但對(duì)于植物全身覆蓋茸 毛的外植體的消毒方式報(bào)道極少，常規(guī)的消毒方式往往會(huì)造成消毒不徹底而污染率較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是常規(guī)的植物組織培養(yǎng)中外植體的消毒方法對(duì)于植物 全身覆蓋茸毛的外植體不適用，往往會(huì)造成消毒不徹底而污染率較高的問(wèn)題。
[0005] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：
[0006] 一種表面帶茸毛植物組織培養(yǎng)時(shí)外植體消毒方法，其特征在于：包括以下步驟：
[0007] (1)母本植株的預(yù)處理：將母本植株移入溫室內(nèi)進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，并進(jìn)行多菌靈噴灑 預(yù)處理；
[0008] (2)外植體的取材；
[0009] (3)外植體的滅菌；
[0010] a.外植體的清洗：采用洗滌劑和水清洗；
[0011] b.外植體的酒精滅菌：采用75%的酒精滅菌；
[0012] c.外植體的升汞滅菌：采取二次升汞消毒；
[0013] (4)外植體的接種。
[0014] 進(jìn)一步的，所述的母本植株的預(yù)處理為在母本植株抽梢前一個(gè)月將其移入溫室 內(nèi)，進(jìn)行一定的肥水管理和病蟲(chóng)害防治，并在取材之前兩天的時(shí)候向芽條上噴灑多菌靈。所 述的多菌靈為50%可濕性粉劑800倍液的多菌靈。這樣對(duì)實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行預(yù)處理既可以減少 外植體表面及茸毛中隱藏的活性微生物的數(shù)量，又可以減少植物組織培養(yǎng)過(guò)程中微生物感 染概率，還可以保持實(shí)驗(yàn)過(guò)程中材料間的一致性，從而提高實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。
[0015] 進(jìn)行外植體的取材時(shí)，在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，外植體的最佳采集時(shí)間是成功建 立組培體系的前提。對(duì)于虎舌紅等的表面帶茸毛植物而言，污染和褐變是影響外植體存活 的重要因素。因此分別在3月中旬、5月中旬、8月中旬和11月中旬進(jìn)行，取頂芽及當(dāng)年生 葉片。
[0016] 進(jìn)一步的，所述的外植體的清洗為切取當(dāng)年生枝條和萌蘗條上的莖尖浸泡在加有 洗滌劑的水中10~60分鐘，用軟刷輕輕刷洗外植體的表面，除去附在外植體表面的污垢和 部分菌體，然后流水沖洗1~2個(gè)小時(shí)。
[0017] 所述的外植體的酒精滅菌為將沖洗后的外植體瀝干水分，在超凈工作臺(tái)內(nèi)放入 75%的酒精中分別消毒30秒、45秒、60秒，用無(wú)菌水沖洗三次。75%的酒精對(duì)植物細(xì)胞具 有強(qiáng)的穿透性的殺傷力，容易使被處理的外植體受到殺害而喪失生活力，因此把握好消毒 時(shí)間是保持外植體活性的關(guān)鍵。
[0018] 進(jìn)一步的，所述的外植體的升汞滅菌為采取二次升汞消毒的方式進(jìn)行消毒處理， 并且每次使用升汞消毒時(shí)在升汞中都含有l(wèi)mol/L的鹽酸。所述的外植體的升汞滅菌為采 用二次升汞消毒措施即先用升汞消毒4分鐘，無(wú)菌水沖洗5次，再用升汞消毒4分鐘，無(wú)菌 水沖洗5次。
[0019] 所述的外植體的接種為將消毒過(guò)的保持有生物活性的外植體接種在預(yù)先準(zhǔn)備好 的加有益培隆的MS培養(yǎng)基里。
[0020] 有益效果：
[0021] 本發(fā)明的表面帶茸毛植物組織培養(yǎng)時(shí)外植體消毒方法對(duì)母株進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)和多菌 靈預(yù)處理，外植體用酒精消毒后，采用二次升汞消毒措施即先用升汞消毒4分鐘，無(wú)菌水沖 洗5次，再用升汞消毒4分鐘，無(wú)菌水沖洗5次，然后接種在含有益培隆的啟動(dòng)培養(yǎng)基中。此 方法能清除虎舌紅外植體表面的污菌并能使外植體保持生活力。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1 :本發(fā)明的技術(shù)路線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0024] 實(shí)施例1
[0025] 1、母本植株的預(yù)處理
[0026] 在母本植株抽梢前一個(gè)月將其移入溫室內(nèi)，進(jìn)行一定的肥水管理和病蟲(chóng)害防治。 在取材前二天向植株上噴灑50%可濕性粉劑800倍液的多菌靈。這樣對(duì)實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行預(yù)處 理既可以減少外植體表面及茸毛中隱藏的活性微生物的數(shù)量，又可以減少植物組織培養(yǎng)過(guò) 程中微生物感染概率，還可以保持實(shí)驗(yàn)過(guò)程中材料間的一致性，從而提高實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。
[0027] 2、取材時(shí)期
[0028] 分別在3月中旬、5月中旬、8月中旬和11月中旬切取頂芽及當(dāng)年生葉片進(jìn)行實(shí) 驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表1)表明8月份是虎舌紅外植體污染率最高期，五月份次之，11月份最 低；就外植體褐變而言，外植體中酚含量及多酚氧化酶的氧化活性在秋季最弱，春季較弱， 以后逐漸增強(qiáng)，從而使褐變加重，8月份取材褐變率最高。從成活率上來(lái)看，虎舌紅外植體 最佳的取材時(shí)期是在三月份，主要是因?yàn)榇藭r(shí)期植株?duì)I養(yǎng)充足，芽生長(zhǎng)點(diǎn)處于活躍時(shí)期，莖 尖、莖段存活率高，同時(shí)此時(shí)期體內(nèi)酚含量和多酚氧化酶活性還未達(dá)到高峰，大大提高了成 活率。
[0029] 表1不同取材時(shí)期虎舌紅污染率、褐變率和成活率
[0031] 3、外植體的清洗為切取當(dāng)年生枝條和萌蘗條上的莖尖浸泡在加有洗滌劑的水中 10~60分鐘，用軟刷輕輕刷洗外植體的表面，除去附在外植體表面的污垢和部分菌體，然 后流水沖洗1~2個(gè)小時(shí)。
[0032] 4、外植體的酒精滅菌
[0033] 實(shí)驗(yàn)將沖洗后的外植體瀝干水分，在操凈工作臺(tái)內(nèi)放入75%的酒精中分別消毒 30秒、45秒、60秒，無(wú)菌水沖洗三次。從表2中可以看出，虎舌紅莖尖適宜的酒精浸泡時(shí)間 是30秒，60秒時(shí)雖然污染率為0,但外植體的死亡率達(dá)到95%，導(dǎo)致其成活率低。
[0034] 表2 75%酒精不同時(shí)間對(duì)外植體的影響
[0036] 5、外植體的升采滅菌
[0037] 本研宄中采取一次升汞消毒和二次升汞消毒的方式進(jìn)行消毒處理（見(jiàn)表3)，
[0038] 表3 0. 1 %升汞不同消毒方法對(duì)外植體的影響
[0040] 注：3+2是指先用升汞消毒3分鐘，無(wú)菌水沖洗3次，再用升汞消毒2分鐘；4+4是 指先用升汞消毒4分鐘，無(wú)菌水沖洗3次，再用升汞消毒4分鐘；5+5是指先用升汞消毒5分 鐘，無(wú)菌水沖洗3次，再用升汞消毒5分鐘。
[0041] 試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4,結(jié)果表明：對(duì)于成活率和污染率而言，相同處理時(shí)間下，二次消 毒處理的外植體的污染率低于一次消毒的外植體，成活率明顯高于一次消毒的外植體，并 且虎舌紅外植體隨著0. 1 %升汞處理的時(shí)間增加污染率降低，但同時(shí)成活率也呈降低的趨 勢(shì)。最佳的處理時(shí)間為用升汞消毒8分鐘和5+3分鐘，既降低了污染率，也大大提高了虎舌 紅外植體的成活率，而處理時(shí)間為10分鐘和5+5分鐘雖然極大程度上降低了外植體的污染 率，但卻使外植體的成活率呈極大地降低趨勢(shì)，分析其原因可能是升汞消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，對(duì)外 植體的毒害作用比較大所致。綜上所述，最佳的處理方法是先用升汞消毒4分鐘，無(wú)菌水沖 洗3次，再用升汞消毒4分鐘，能提高虎舌紅的成活率，降低其污染率。
[0042] 6、將消毒過(guò)的保持有生物活性的外植體接種在預(yù)先準(zhǔn)備好的加有益培隆的MS培 養(yǎng)基里。
[0043] 表4 0. 1 %升汞不同處理時(shí)間和方式對(duì)虎舌紅污染率和成活率的影響
[0044]
[0045] 以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，任何熟 悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)，對(duì)以上實(shí) 施例所作的任何簡(jiǎn)單的修改、等同替換與改進(jìn)等，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍之 內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種表面帶茸毛植物組織培養(yǎng)時(shí)外植體消毒方法，其特征在于：包括以下步驟： (1) 母本植株的預(yù)處理：將母本植株移入溫室內(nèi)進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，并進(jìn)行多菌靈噴灑預(yù)處 理； (2) 外植體的取材； (3) 外植體的滅菌； a. 外植體的清洗：采用洗滌劑和水清洗； b. 外植體的酒精滅菌：采用75%的酒精滅菌； c. 外植體的升汞滅菌：采取二次升汞消毒； (4) 外植體的接種。2. 如權(quán)利要求1所述的表面帶茸毛植物組織培養(yǎng)時(shí)外植體消毒方法，其特征在于：所 述的母本植株的預(yù)處理為在母本植株抽梢前一個(gè)月將其移入溫室內(nèi)，進(jìn)行一定的肥水管理 和病蟲(chóng)害防治，并在取材之前兩天的時(shí)候向芽條上噴灑多菌靈。3. 如權(quán)利要求1所述的表面帶茸毛植物組織培養(yǎng)時(shí)外植體消毒方法，其特征在于：所 述的多菌靈為50%可濕性粉劑800倍液的多菌靈。4. 如權(quán)利要求1所述的表面帶茸毛植物組織培養(yǎng)時(shí)外植體消毒方法，其特征在于：所 述的外植體的取材為分別在3月中旬、5月中旬、8月中旬和11月中旬進(jìn)行，取頂芽及當(dāng)年 生葉片。5. 如權(quán)利要求1所述的表面帶茸毛植物組織培養(yǎng)時(shí)外植體消毒方法，其特征在于：所 述的外植體的清洗為切取當(dāng)年生枝條和萌蘗條上的莖尖浸泡在加有洗滌劑的水中10~60 分鐘，用軟刷輕輕刷洗外植體的表面，除去附在外植體表面的污垢和部分菌體，然后流水沖 洗1~2個(gè)小時(shí)。6. 如權(quán)利要求1所述的表面帶茸毛植物組織培養(yǎng)時(shí)外植體消毒方法，其特征在于：所 述的外植體的酒精滅菌為將沖洗后的外植體瀝干水分，在超凈工作臺(tái)內(nèi)放入75%的酒精中 分別消毒30秒、45秒、60秒，用無(wú)菌水沖洗三次。7. 如權(quán)利要求1所述的表面帶茸毛植物組織培養(yǎng)時(shí)外植體消毒方法，其特征在于：所 述的外植體的升汞滅菌為采取二次升汞消毒的方式進(jìn)行消毒處理，并且每次使用升汞消毒 時(shí)在升采中都含有l(wèi)mol/L的鹽酸。8. 如權(quán)利要求1所述的表面帶茸毛植物組織培養(yǎng)時(shí)外植體消毒方法，其特征在于：所 述的外植體的升汞滅菌為采用二次升汞消毒措施即先用升汞消毒4分鐘，無(wú)菌水沖洗5次， 再用升汞消毒4分鐘，無(wú)菌水沖洗5次。9. 如權(quán)利要求1所述的表面帶茸毛植物組織培養(yǎng)時(shí)外植體消毒方法，其特征在于：所 述的外植體的接種為將消毒過(guò)的保持有生物活性的外植體接種在預(yù)先準(zhǔn)備好的加有益培 隆的MS培養(yǎng)基里。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種表面帶茸毛植物組織培養(yǎng)時(shí)外植體消毒方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域中的植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的表面帶茸毛植物組織培養(yǎng)時(shí)外植體消毒方法對(duì)母株進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)和多菌靈預(yù)處理，外植體用酒精消毒后，采用二次升汞消毒措施即先用升汞消毒4分鐘，無(wú)菌水沖洗5次，再用升汞消毒4分鐘，無(wú)菌水沖洗5次，然后接種在含有益培隆的啟動(dòng)培養(yǎng)基中。此方法能清除虎舌紅外植體表面的污菌并能使外植體保持生活力。
【IPC分類】A01H4/00
【公開(kāi)號(hào)】CN104920224
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510391257
【發(fā)明人】曾云英, 韓承輝, 符嫦娥, 葉海躍, 萬(wàn)強(qiáng), 馬存琛
【申請(qǐng)人】江蘇城市職業(yè)學(xué)院
【公開(kāi)日】2015年9月23日
【申請(qǐng)日】2015年7月6日