鐵皮石斛快速繁殖成苗的培養(yǎng)基系列及組培方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及藥用植物種苗的繁殖方法，具體來說涉及一種鐵皮石斛快速繁殖培養(yǎng)基系列以及組培方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鐵皮石斛種子細(xì)如粉塵，一個(gè)蒴果內(nèi)所含種子達(dá)100萬粒之多。由于缺乏胚乳，種子需與真菌共生才能萌發(fā)，自然條件下萌發(fā)率非常低(不足5%)。鐵皮石斛自然繁殖力極低，常規(guī)繁殖又較困難，且多年來對鐵皮石斛的采集量遠(yuǎn)大于其生長量，野生鐵皮石斛自然繁殖已瀕臨絕跡。為發(fā)展人工栽培滿足市場需求，藥用石斛中的一些珍貴品種已成為目前組織快繁研宄的重點(diǎn)。
[0003]目前關(guān)于鐵皮石斛的組織培養(yǎng)研宄已經(jīng)有相關(guān)報(bào)道，但是組織培養(yǎng)所需的成本過高和試管成苗周期長的問題是制約鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)化大生產(chǎn)的瓶頸。因此亟需一種能快速繁殖鐵皮石斛的組織培養(yǎng)體系，為推廣人工培植技術(shù)和大規(guī)模工廠化育苗奠定理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明從鐵皮石斛種子培養(yǎng)入手，對鐵皮石斛組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基組分，通過多年的實(shí)驗(yàn)摸索發(fā)現(xiàn)，能快速繁殖鐵皮石斛且能夠周年生產(chǎn)的組織培養(yǎng)體系，為工廠化育苗提供技術(shù)支撐。該鐵皮石斛快速繁殖培養(yǎng)基系列能夠明顯提高鐵皮石斛種子的萌發(fā)時(shí)間，從傳統(tǒng)的75天左右的時(shí)間直接縮短為14-25天，并且野生種子萌發(fā)率高達(dá)96-98 %，鐵皮石斛組培苗移栽成活率高達(dá)98 %。
[0005]本發(fā)明提出一種鐵皮石斛快速繁殖培養(yǎng)基系列，其技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的:
[0006]一種鐵皮石斛快速繁殖成苗的培養(yǎng)基系列，該培養(yǎng)基系列包括播種培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、壯苗培養(yǎng)基、分化苗培養(yǎng)基以及生根培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基各組成成分含量分別為:
[0007]播種培養(yǎng)基:1000暈升A液體、1000暈升B液體、100暈升C液體、100暈升D液體、20毫升L液體、8毫升Ml液體、380-420g蔗糖、74_78g瓊脂、34_38g碳粉、1900_2100g土豆、蘋果或者香蕉與10升水；
[0008]增殖培養(yǎng)基:1000暈升A液體、1000暈升B液體、100暈升C液體、100暈升D液體、20暈升L液體、8暈升Ml液體、5暈升M2液體、380_420g鹿糖、74_78g瓊脂、34_38g碳粉、1900-2100g 土豆、蘋果或者香蕉與10升水；
[0009]壯苗培養(yǎng)基:1000暈升A液體、1000暈升B液體、100暈升C液體、100暈升D液體、20暈升L液體、15暈升Ml液體、10暈升M2液體、380_420g鹿糖、74_78g瓊脂、38_42g碳粉、1900-2100g 土豆、蘋果或者香蕉與10升水；
[0010]分化苗培養(yǎng)基:1000暈升A液體、1000暈升B液體、100暈升C液體、100暈升D液體、20暈升L液體、15暈升Ml液體、15暈升M2液體、、380_420g鹿糖、74_78g瓊脂、38_42g碳粉、1900-2100g 土豆、蘋果或者香蕉與10升水；
[0011]生根培養(yǎng)基:1000暈升A液體、1000暈升B液體、100暈升C液體、100暈升D液體、20暈升L液體、20暈升Ml液體、10暈升M2液體、480_520g鹿糖、74_78g瓊脂、38_42g碳粉、2400-2600g 土豆或者香蕉與10升水；
[0012]其中，所述A液體、B液體、C液體、D液體、L液體、Ml液體與M2液體中元素組成分別為:
[0013]A液體:16.5g/L硝酸銨、19.0g/L硝酸鉀、3.7g/L硫酸鎂與1.7g/L磷酸二氫鉀；
[0014]B液體:4.4g/L氯化鈣；
[0015]C液體:0.4g/L甘氨酸、0.02g/L維生素B1、0.lg/L煙酸、0.lg/L鹽酸比哆辛VB6與20g/L肌醇；
[0016]D液體:5.56g/L硫酸亞鐵與7.46g/L乙二胺四乙酸二鈉；
[0017]L 液體:16.9g/L 硫酸錳、8.6g/L 硫酸鋅、6.2g/L 硼酸、0.83g/L 碘化鉀、0.025g/L硫酸銅、0.025g/L氯化鈷與0.25g/L鉬酸鈉；
[0018]Ml液體:0.5g/La—奈乙酸與0.4g/L氫氧化鈉；
[0019]M2液體:0.5g/L 6_芐基腺嘌呤與0.4g/L氫氧化鈉。
[0020]進(jìn)一步，所述播種培養(yǎng)基的pH值為5.4-5.8，用酸堿調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)所述播種培養(yǎng)基的pH值，即培養(yǎng)基發(fā)黃則添加氫氧化鈉調(diào)節(jié)，發(fā)黑則添加鹽酸調(diào)節(jié)；所述增殖培養(yǎng)基的pH值為5.4-5.8，用酸堿調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)所述增殖培養(yǎng)基的pH值，即培養(yǎng)基發(fā)黃則添加氫氧化鈉調(diào)節(jié)，發(fā)黑則添加鹽酸調(diào)節(jié)；所述壯苗培養(yǎng)基的PH值為5.4-5.8，用酸堿調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)所述壯苗培養(yǎng)基的PH值，即培養(yǎng)基發(fā)黃則添加氫氧化鈉調(diào)節(jié)，發(fā)黑則添加鹽酸調(diào)節(jié)；所述分化苗培養(yǎng)基的PH值為5.4-5.8，用酸堿調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)所述分化苗培養(yǎng)基的pH值，即培養(yǎng)基發(fā)黃則添加氫氧化鈉調(diào)節(jié)，發(fā)黑則添加鹽酸調(diào)節(jié)；所述生根苗培養(yǎng)基的PH值為5.4-5.8，用酸堿調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)所述生根苗培養(yǎng)基的PH值，即培養(yǎng)基發(fā)黃則添加氫氧化鈉調(diào)節(jié)，發(fā)黑則添加鹽酸調(diào)節(jié)。
[0021]進(jìn)一步，所述培養(yǎng)基及所述A液體、B液體、C液體、D液體、L液體、Ml液體與M2液體中所用的水均為礦泉水。
[0022]本發(fā)明還公開了使用上述培養(yǎng)基系列由鐵皮石斛快速繁殖成苗的組培方法，其步驟如下:
[0023]⑴鐵皮石斛種子的無菌萌發(fā)
[0024]采集鐵皮石斛蒴果種子，依次用酒精與次氯酸鈉溶液進(jìn)行消毒滅菌，將滅菌后的種子的一端將其切開，將粉末狀胚均勻的播撒到播種培養(yǎng)基上，在有光照的組培室培養(yǎng)14-25天，萌發(fā)的種子形成原球莖，保持組培室溫度在22-25°C ；
[0025]⑵鐵皮石斛原球莖的增殖
[0026]將種子萌發(fā)形成的原球莖均勻轉(zhuǎn)入到增殖培養(yǎng)基中，置于組培室進(jìn)行光照培養(yǎng)，保持組培室溫度在22-25°C，原球莖長出淡黃色愈傷組織，22-27天，愈傷組織不斷分離增殖成類原球莖；
[0027]⑶鐵皮石斛類原球莖的分化
[0028]將類原球莖挑出并均勻轉(zhuǎn)入到分化培養(yǎng)基中，置于組培室進(jìn)行光照培養(yǎng)，保持組培室溫度在22-25°C，26-30天，類原球莖分化成小苗；
[0029]⑷鐵皮石斛小苗的壯苗
[0030]將小苗放置在預(yù)先消毒過的大培養(yǎng)皿上，并把小苗插入到壯苗培養(yǎng)基中，置于組培室進(jìn)行光照培養(yǎng)，保持組培室溫度在22-25°C，32-45天，小苗成長為長勢良好的鐵皮石斛大苗；
[0031](5)鐵皮石斛大苗的生根
[0032]將大苗放置在預(yù)先消毒過的大培養(yǎng)皿上，并把大苗插入到生根培養(yǎng)基中，置于組培室進(jìn)行光照培養(yǎng)，保持組培室溫度在22-25°C，32-60天，大苗成長為完整的鐵皮石斛組培苗。
[0033]本發(fā)明的有益效果:
[0034]本發(fā)明通過對播種培養(yǎng)基組分調(diào)節(jié)，使得通過該培養(yǎng)基播種的鐵皮石斛種子無需經(jīng)過黑暗培養(yǎng)時(shí)間，直接進(jìn)行光照處理，14-25天左右萌發(fā)的種子形成原球莖，萌發(fā)率達(dá)到96-98% ;進(jìn)一步，對增殖培養(yǎng)基、壯苗培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基以及生根培養(yǎng)基的組分調(diào)整，使得生長出來的鐵皮石斛組培苗健壯，移栽成活率高達(dá)98%。生根培養(yǎng)基優(yōu)選采用香蕉，使用香蕉的生根培養(yǎng)基成苗時(shí)間為32-45天，而使用土豆的生根培養(yǎng)基成苗時(shí)間為46-60天。
【附圖說明】
[0035]圖1為鐵皮石斛原球莖照片；
[0036]圖2為鐵皮石斛類原球莖照片；
[0037]圖3為鐵皮石斛小苗照片；
[0038]圖4為鐵皮石斛組培苗照片。
【具體實(shí)施方式】
[0039]實(shí)施例1
[0040]配制A液體:稱取硝酸銨16.5g、硝酸鉀19.0g、硫酸鎂3.7g、磷酸二氫鉀1.7g，然后加入IL水中混勻溶解，即可。
[0041]配制B液體:稱取氯化媽4.4g，然后放入IL水中混勻溶解，即可。
[0042]配制C液體:稱取甘氨酸0.4g、0.02g維生素B1、煙酸0.1g與0.1g鹽酸比哆辛VB6加入800ml水中混勻溶解得到混合液I，再稱取20g肌醇用200ml水混勻溶解得到混合液II，將混合液I與混合液II混合即可。
[0043]配制D液體:稱取5.56g硫酸亞鐵與7.46g乙二胺四乙酸二鈉，用水分別溶解后，再混勻配制成IL溶液。
[0044]配制L液體:稱取16.9g/L硫酸錳、8.6g/L硫酸鋅、6.2g/L硼酸、0.83