一種培育廣譜、持久穗瘟抗性水稻育種材料的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于水稻分子育種技術領域，涉及一種培育廣譜、持久穗瘟抗性水稻育種 材料的方法。
【背景技術】
[0002] 由真菌Magnaportheoryzae引起的稻瘟病是水稻最嚴重病害之一，嚴重威脅著水 稻的持續(xù)高產和穩(wěn)產。據(jù)統(tǒng)計，全球每年因稻瘟病造成的產量損失達10% -30%，直接經(jīng) 濟損失約50億美元，損失的糧食足以養(yǎng)活6000萬人。在我國，稻瘟病每年都有不同程度 的發(fā)生，特別是近幾年，在西南、長江中下游和東北等稻作區(qū)持續(xù)大發(fā)生，年發(fā)病面積達330 萬~570萬ha，損失稻谷數(shù)億公斤，給我國水稻安全生產帶來了巨大隱患。實踐證明，利用 抗病基因培育抗性品種是最為經(jīng)濟有效的病害控制措施之一。但是由于稻瘟病菌的致病性 分化嚴重，生理小種多，變異頻繁，給抗病品種的選育帶來了困難，含有單個抗病基因的抗 病品種往往推廣種植3-5年便"喪失"抗病性而成為感病品種。因此，聚合幾個/多個抗性 基因，一直被認為是培育廣譜、持久抗性品種的另一個有效途徑。而對于不同稻瘟病基因的 聚合效應，研宄結果并不一致。如陳紅旗等（2008)、Jiangetal(2012)和Fuetal(2012) 分別報道聚合Pil/Pi2/Pi33三基因、Pil/Pi2/D12三基因、Pil/Pi2兩基因的品系對中國 南方稻區(qū)稻瘟病菌株具有廣譜抗性。而IRRI以C〇39為背景，構建了分別攜帶PiUPiz5和 Pita的單基因系，以及分別攜帶2-3個抗性基因的聚合系，鑒定結果顯示雖然多基因聚合 系一般具有較強的抗性，但Piz5和Pita的抗性基因聚合系抗性反而不如單基因抗性品系 (Hittalmanietal, 2000);同樣的一套材料在中國的鑒定試驗中也發(fā)現(xiàn)Pil和Pita的聚 合系不如單基因抗性品系（何月秋等，2001)。
[0003] 稻瘟病的發(fā)生，根據(jù)其發(fā)生時期及部位，可分為苗瘟以及成株期的葉瘟、節(jié)瘟、穗 瘟、谷粒瘟等，其中以苗瘟及穗瘟等最為常見。苗瘟抗性接種鑒定，由于具有操作簡便、流程 易標準化、易實現(xiàn)針對大規(guī)模的遺傳分析群體的鑒定等優(yōu)點，而得以廣泛應用。目前，已經(jīng) 定位或克隆的稻瘟病抗性基因，絕大多數(shù)是利用苗瘟鑒定方法鑒別的。上述提到的Pil、Pi2 與Pi33、D12,以及PiUPiz5和Pita的多基因聚合效應，也主要是針對苗瘟抗性而言的。而 穗瘟，對水稻生產的危害程度要顯著高于苗瘟、葉瘟等，但是由于穗瘟的接種鑒定存在誤差 大、流程難以標準化、接種工作量大等缺陷，一直很難大規(guī)模開展應用，針對不同基因/基 因聚合的穗瘟抗性效應分析，因而也就非常缺乏。
[0004] 近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，水稻基因組測序的完成，越來越多的稻瘟病抗性 基因被定位，目前已經(jīng)鑒定了 80多個稻瘟病抗性基因，其中有超過20多個抗病基因被克 隆。我們利用已克隆的稻瘟病抗性基因功能性及緊密連鎖分子標記對我國目前生產上的育 種主體親本進行基因型檢測，結合苗瘟抗性鑒定結果，通過多元回歸模型及相關性分析初 步明確了位于水稻第6染色體短臂的Pigm與位于第11染色體長臂的Pi54具有良好的苗 瘟抗性互補性。
[0005] Pigm位于水稻第6染色體短臂，與Pi2、Pi9等廣譜稻瘟病抗性基因等位或緊密連 鎖，其對中國南方稻區(qū)不同菌株具有良好的苗瘟抗性（Dengetal，2006)。Pi54位于第11 染色體長臂，是Pik基因簇中的NBS-LRR成員之一，并對印度的不同稻瘟病菌株具有良好的 苗瘟抗性（Sharmaetal，2005;Ramkumaretal，2011)。，但目前尚未有研宄報道這兩個基 因聚合后是否具備穗瘟抗性效應。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種抗穗瘟水稻育種材料的培育方法。通過回交、分子標 記輔助選擇、農藝性狀評價及抗性鑒定等方法創(chuàng)制抗穗瘟的水稻育種材料。為了實現(xiàn)本發(fā) 明的技術目的，本發(fā)明采用的技術方案如下：
[0007] 一種培育廣譜、持久穗瘟抗性育種材料的方法，其特征包含以下具體步驟：
[0008] (1)輪回親本分別與抗性基因供體谷梅4號和K3雜交，獲得雜交F1R，分別以 F1-PignuF1-PiSA表示；其中谷梅4號攜帶的抗性基因為Pigm，K3攜帶的抗性基因為Pi54 ;
[0009] ⑵種植F1-Pigm和F「Pi54種子，開花期分別與輪回親本回交得到回交1代，分 別以BC1F1-Pigm和BC1F1-PiSA表示；
[0010] ⑶種植BC1F1-PignuBC1F1-PiSd種子，在苗期提取各BC1F1分離群體中單株DNA， 并利用與目標基因緊密連鎖的分子標記進行PCR檢測，選擇含有Pigm和Pi54基因且農藝 性狀和輪回親本相似的雜合型單株在開花期繼續(xù)與輪回親本雜交獲得BC2F1分離群體，并 以BC2F1-Pigm和BC2FrPi54 表示；
[0011] (4)重復步驟（3)，直至回交6代，獲得BC6F1-Pigm和BC6F「Pi54并進行種植，苗期 提取各BC6F1分離群體中單株DNA，并利用與目標基因緊密連鎖的分子標記進行PCR檢測， 分別選擇含有Pigm和Pi54基因的BC6F1雜合型單株在開花期進行聚合雜交，獲得高質量雜 種F1種子，并以BC6F IPigm/Pi54^^'J、?
[0012] (5)種植BC6F1-Pwpi54群體，苗期提取分離群體中各單株DNA，并利用與目標基因緊 密連鎖的分子標記進行PCR檢測，選擇同時含有Pigm和Pi54基因的雜合型單株收獲種子， 獲得雙基因的BC6F2代群體，以BC6F2 Pigm/Pi54^^'J、;
[0013] (6)將BC6F2-Pigm/Pi54種植成1000株以上的群體規(guī)模，在苗期提取分咼群體中單株 的DNA，并利用與目標基因緊密連鎖的分子標記繼續(xù)進行PCR檢測，選擇Pigm和Pi54雙基 因純合且農藝性狀和輪回親本最為相似的單株；
[0014] (7)收獲Pigm和Pi54雙基因純合的目標單株種子種植成BC6F3株系，開展穗瘟抗 性的人工接種和病圃自然誘發(fā)鑒定，同時開展農藝性狀評價；選擇人工接種和病圃自然誘 發(fā)鑒定中均表現(xiàn)抗病、且基本農藝性狀與輪回親本無明顯差異的株系，獲得穗瘟抗性得到 改良的育種材料。
[0015] 其中，與目標基因Pigm緊密連鎖的分子標記優(yōu)選ZJ58. 7,與目標基因Pi54緊密連 鎖的分子標記優(yōu)選Mil. 54。
[0016] 分子標記ZJ58. 7正向引物優(yōu)選SEQIDNO. 1所示，反向引物優(yōu)選SEQIDNO. 2所 不O
[0017] 分子標記Ml1.54正向引物優(yōu)選SEQIDNO. 3所示，反向引物優(yōu)選SEQIDNO. 4所 不O
[0018] 所述的輪回親本為優(yōu)良常規(guī)品種或兩系雜交稻親本揚稻6號。
[0019] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0020] 1)本發(fā)明采用分子標記輔助選擇在每個回交世代對目標基因進行選擇，無需田間 接種鑒定，簡化了育種程序。
[0021] 2)本發(fā)明在分離世代針對目標抗性基因采用分子標記輔助選擇的同時，不斷采用 目測的方法選擇農藝性狀與輪回親本最為相似的個體進行雜交和自交，獲得初步成型的株 系后再進行農藝性狀評價，減少了累贅連鎖和遺傳背景回復度的檢測步驟，提高了育種選 擇效率。
[0022] 3)本發(fā)明利用的兩個目標抗性基因，這兩個基因在具備苗瘟抗性的同時還具備穗 瘟抗性，其穗瘟抗譜重疊度小而互補性強，通過連續(xù)回交，并結合分子標記輔助選擇，實現(xiàn) 在育種材料中的聚合，構建的聚合有Pigm/Pi54雙基因的育種材料，能夠減緩稻瘟病菌的 突變速率，保證目標材料穗瘟抗性的廣譜、持久性。
【附圖說明】
[0023] 圖1為針對目標抗性基因Pigm和Pi54雙基因純合體的選擇不意圖。泳道1為供 體親本谷梅4號或K3 ;2為輪回親本揚稻6號；3-20為BC6F2自交群體的部分單株。紅色箭 頭標示目標雙基因純合體。
[0024] 圖2為目標改良系YD6-Pigm/Pi54的穗瘟抗性表現(xiàn)。圖2A為利用南方稻區(qū)分離 的120個單孢菌株的穗瘟抗性人工接種鑒定結果；圖2B為湖北恩施、江西遂川和安徽金寨 3個病圃穗瘟抗性自然誘發(fā)鑒定結果；圖2C為2007-2014年間利用湖北、海南和江蘇3省 分離的單孢菌株的穗瘟抗性人工接種鑒定結果。
【具體實施方式】[0025] 實施例1
[0026] (1)以攜帶抗性基因Pigm的供體親本谷梅4號（YiwenDeng,etal.Genetic characterizationandfinemappingoftheblastresistancelocusPigm(t) tightlylinkedtoPi2andPi9inabroad-spectrumresistantChinesevariety. TheoreticalandAppliedGenetics, 2006, 113(