一種利用礦物油覆蓋延長(zhǎng)葡萄組培苗保存時(shí)間的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行葡萄種質(zhì)資源離體保存的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]由于人口增長(zhǎng)、工業(yè)污染、環(huán)境惡化等原因，一些稀有物種面臨滅絕或?yàn)l于絕種，加上人工選擇及良種的推廣，種植品種單一化，許多有益的珍貴種質(zhì)資源丟失，植物種質(zhì)資源保存已成為全球性關(guān)注的課題。
[0003]離體保存種質(zhì)資源是將植物外植體在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行組織培養(yǎng)保存，具有很高的繁殖系數(shù)，需要時(shí)能將保存材料大量繁殖；可克服田間保存法的缺點(diǎn)，不占用土地，免去田間管理；免受自然災(zāi)害侵襲及病蟲(chóng)、病毒危害；易于控制及便于種質(zhì)交流；已成為植物種質(zhì)資源保存的重要方法，受到國(guó)際植物界的高度重視。
[0004]在組織培養(yǎng)保存種質(zhì)的過(guò)程中，由于培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，營(yíng)養(yǎng)消耗，每隔一段時(shí)間，要將培養(yǎng)物及時(shí)轉(zhuǎn)移接種到新培養(yǎng)基中，進(jìn)行繼代培養(yǎng)。葡萄組培苗一般2個(gè)月繼代一次，最長(zhǎng)可保存4個(gè)月左右，頻繁繼代要消耗大量的人力、物力和時(shí)間，隨繼代次數(shù)的增加，還會(huì)導(dǎo)致體細(xì)胞無(wú)性系變異幾率增加，有可能使保存的原始種質(zhì)丟失。通過(guò)改變培養(yǎng)物生長(zhǎng)條件，調(diào)控組培苗的生長(zhǎng)節(jié)奏，延緩其生長(zhǎng)，可以有效減少繼代次數(shù)，改良種質(zhì)資源離體保存方法。
[0005]延緩組培苗生長(zhǎng)的主要途徑有:在培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)延緩劑；提高培養(yǎng)基滲透壓；降低培養(yǎng)溫度，改變光照強(qiáng)度；降低培養(yǎng)環(huán)境的氧氣含量等。蘋(píng)果等木本植物組培苗放入冷藏箱，降低培養(yǎng)溫度后延緩生長(zhǎng)的效果很好，但葡萄抗寒性較差，大部分品種不能長(zhǎng)期適應(yīng)10°C以下冷藏箱的條件。通過(guò)在培養(yǎng)基中添加PP333等生長(zhǎng)延緩劑或加入甘露醇提高培養(yǎng)基滲透壓可有效抑制葡萄組培苗生長(zhǎng)，但由于室溫下培養(yǎng)，封口材料透氣，培養(yǎng)基水分蒸發(fā)殆盡，葡萄組培苗只能延長(zhǎng)約3個(gè)月的保存時(shí)間。本發(fā)明利用礦物油覆蓋葡萄組培苗，有效抑制了培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，通過(guò)降低培養(yǎng)環(huán)境的氧氣含量，延緩了組培苗生長(zhǎng)，延長(zhǎng)了保存時(shí)間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明建立了一種延長(zhǎng)葡萄組培苗保存時(shí)間的方法，為有效利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行葡萄種質(zhì)資源的離體保存提供技術(shù)支撐。
[0007]本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是:將葡萄組培苗嫩梢去掉葉片，切分成單芽莖段接種，在培養(yǎng)基表面倒入無(wú)菌礦物油覆蓋組培苗，常規(guī)培養(yǎng)條件培養(yǎng)，可有效延長(zhǎng)葡萄組培苗的保存時(shí)間。
[0008]本發(fā)明的具體內(nèi)容，即延長(zhǎng)葡萄組培苗保存時(shí)間的具體方法步驟如下:
(I)制備葡萄繼代培養(yǎng)基:B5+IAA0.5mg/L+蔗糖25.0g/L+瓊脂6.0g/L,培養(yǎng)基滅菌前調(diào)節(jié)pH6.0 ;培養(yǎng)容器采用50ml或10ml三角瓶，若考慮節(jié)省礦物油，可選用50ml三角瓶。
[0009](2)將葡萄組培苗嫩梢去掉葉片，切分成1.5cm左右的單芽莖段，接入培養(yǎng)基中；在培養(yǎng)基表面倒入無(wú)菌礦物油，礦物油液面高出培養(yǎng)基表面5-6cm，50ml三角瓶約需40ml，10ml三角瓶約需80ml，用封口膜封口。
[0010](3)常規(guī)培養(yǎng)條件:溫度25±3°C，光照強(qiáng)度20001x左右，光照時(shí)間10_14h/d。
[0011](4)覆蓋礦物油的葡萄組培苗一般可保存15個(gè)月以上。
[0012](5)去掉礦物油后，無(wú)需沖洗，保存的組培苗即可恢復(fù)生長(zhǎng)。
[0013]本發(fā)明專利的有益效果是，通過(guò)礦物油覆蓋，顯著減少了培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，降低了培養(yǎng)環(huán)境的氧氣含量，有效延緩了葡萄組培苗生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)消耗，成功將葡萄組培苗的保存時(shí)間由4個(gè)月延長(zhǎng)至15個(gè)月以上，大大減少了繼代接種的工作量，也降低了變異幾率。該技術(shù)可應(yīng)用于巨玫瑰、莫麗莎、巨峰、夏黑、粒粒特、皇家夏天、皇家秋天、克瑞森、赤霞珠、紅斯威特等葡萄品種組培苗，具有適應(yīng)品種廣、保存時(shí)間長(zhǎng)、成本低(礦物油可重復(fù)利用)、操作簡(jiǎn)便、易恢復(fù)生長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，是目前葡萄種質(zhì)離體保存的好方法。
【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1接種后覆蓋礦物油的葡萄組培苗。
[0015]圖2保存了 15個(gè)月的葡萄組培苗。
[0016]
【具體實(shí)施方式】
[0017]通過(guò)礦物油覆蓋，減少了培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，降低了培養(yǎng)環(huán)境的氧氣含量，有效延緩了葡萄組培苗生長(zhǎng)，成功延長(zhǎng)了葡萄組培苗的保存時(shí)間。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，具體實(shí)施過(guò)程要注意以下問(wèn)題:(1)葡萄組培苗接種時(shí)最好去掉嫩梢葉片，只留約1.5cm長(zhǎng)的單芽莖段，腋芽在礦物油中萌發(fā)緩慢，節(jié)間縮短，葉片明顯減小，生根晚，根細(xì)且短小，無(wú)側(cè)根，延緩生長(zhǎng)效果好。(2)接種后要立即覆蓋無(wú)菌礦物油，如果接種后先培養(yǎng)一段時(shí)間，待腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)后再覆蓋礦物油，容易造成組培苗很快枯尖、死亡，保存時(shí)間短。(3)覆蓋礦物油最好一次加夠量，如果只高出培養(yǎng)基表面2-3cm，組培苗5-6個(gè)月后即長(zhǎng)出礦物油液面，開(kāi)始恢復(fù)生長(zhǎng)，繼續(xù)存活3-4個(gè)月即干枯死亡。因此礦物油應(yīng)盡量多加，一般高出培養(yǎng)基表面5-6cm，將到三角瓶瓶頸即可，50ml三角瓶約需40ml，10ml三角瓶約需80ml，用封口膜封口。如果開(kāi)始礦物油加量不夠，待組培苗快長(zhǎng)出液面時(shí)可以添加，只是既麻煩、又增加帶菌污染的幾率。在常規(guī)培養(yǎng)條件下，礦物油覆蓋法已成功保存了巨玫瑰、莫麗莎、巨峰、夏黑、粒粒特、皇家夏天、皇家秋天、克瑞森、赤霞珠、紅斯威特等十幾個(gè)葡萄組培種質(zhì)及部分花卉組培苗達(dá)15個(gè)月以上。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種利用礦物油覆蓋延長(zhǎng)葡萄組培苗保存時(shí)間的方法，其特征在于將葡萄組培苗嫩梢去掉葉片，切分成1.5cm左右的單芽莖段，接入B5+IAA0.5mg/L+蔗糖25.0g/L+瓊脂6.0g/L的培養(yǎng)基中；在培養(yǎng)基表面倒入無(wú)菌礦物油，礦物油高出培養(yǎng)基表面5-6cm，50ml三角瓶約需40ml，10ml三角瓶約需80ml，用封口膜封口 ；培養(yǎng)條件為:溫度25±3°C，光照強(qiáng)度20001x左右，光照時(shí)間10-14h/d ;在需要恢復(fù)生長(zhǎng)時(shí)，將礦物油在超凈工作臺(tái)中倒出，無(wú)需沖洗，組培苗即可恢復(fù)生長(zhǎng)，操作簡(jiǎn)便，適用于絕大多數(shù)葡萄品種。2.根據(jù)權(quán)利I所述的延長(zhǎng)葡萄組培苗保存時(shí)間的方法，其特征在于葡萄組培苗接種時(shí)不留葉片，切分成1.5cm左右的單芽莖段。3.根據(jù)權(quán)利I所述的延長(zhǎng)葡萄組培苗保存時(shí)間的方法，其特征在于葡萄組培苗接種后，立即覆蓋高出培養(yǎng)基表面5-6cm的無(wú)菌礦物油，50ml三角瓶約需40ml，10ml三角瓶約需 80ml。4.根據(jù)權(quán)利I所述的延長(zhǎng)葡萄組培苗保存時(shí)間的方法，其特征在于覆蓋了礦物油的葡萄組培苗在常規(guī)組培條件(溫度25±3°C，光照強(qiáng)度20001x左右，光照時(shí)間10_14h/d)下培養(yǎng)即可將保存時(shí)間由4個(gè)月延長(zhǎng)至15個(gè)月以上。5.根據(jù)權(quán)利I所述的延長(zhǎng)葡萄組培苗保存時(shí)間的方法，其特征在于礦物油覆蓋保存的組培苗需要恢復(fù)生長(zhǎng)時(shí)，將礦物油在超凈工作臺(tái)中倒出，無(wú)需沖洗，組培苗即可恢復(fù)生長(zhǎng)，操作簡(jiǎn)便，適用于絕大多數(shù)葡萄品種。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用礦物油覆蓋延長(zhǎng)葡萄組培苗保存時(shí)間的方法，將葡萄組培苗嫩梢去掉葉片，切分成約1.5cm單芽莖段，接入繼代培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基表面覆蓋約5-6cm無(wú)菌礦物油，封口膜封口，常規(guī)培養(yǎng)條件（溫度25±3℃，光照強(qiáng)度2000lx左右，光照時(shí)間10-14h/d）培養(yǎng)，可將葡萄組培苗的保存時(shí)間由4個(gè)月延長(zhǎng)至15個(gè)月以上，大大減少了繼代接種的工作量，也降低了變異幾率。去掉礦物油后，無(wú)需沖洗，保存的組培苗即可恢復(fù)生長(zhǎng)。該技術(shù)應(yīng)用于葡萄組培苗種質(zhì)保存，適應(yīng)品種廣，保存時(shí)間長(zhǎng)，礦物油可重復(fù)利用成本低，操作簡(jiǎn)便，易恢復(fù)生長(zhǎng)，是目前葡萄種質(zhì)離體保存的好方法。
【IPC分類】A01N3/00, A01H4/00
【公開(kāi)號(hào)】CN104969857
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410147430
【發(fā)明人】杜國(guó)強(qiáng), 師校欣, 徐志微
【申請(qǐng)人】河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年10月14日
【申請(qǐng)日】2014年4月14日