一種制備構(gòu)樹體細(xì)胞胚的方法及其在構(gòu)樹擴繁中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種制備構(gòu)樹體細(xì)胞胚的方法及其在構(gòu)樹擴繁中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]構(gòu)樹又稱楮樹，Broussoneti Papyrifera(L) Vent，屬?？浦参锏穆淙~喬木，各種類型的土壤幾乎都能生長，極少病蟲害，耐干冷，耐濕熱，根系發(fā)達，是保護生態(tài)環(huán)境和水土保持的一種優(yōu)良樹種。構(gòu)樹一年栽植，多年收獲。構(gòu)樹全身都能利用:樹皮纖維潔白、細(xì)長，是高檔的造紙和紡織原料，價值高，市場需求量大；木桿是生產(chǎn)紙張、纖維板的好原料；樹葉含有豐富的粗蛋白、氨基酸、微量元素，是動物的優(yōu)質(zhì)飼料原料。采用高密度栽培技術(shù)種植構(gòu)樹，畝產(chǎn)韌皮纖維200公斤，木桿1500公斤，優(yōu)質(zhì)飼料樹葉1500公斤。由于構(gòu)樹具有綠化和其他經(jīng)濟價值，市場對于構(gòu)樹種苗的需求非常大，每年將達到2000萬株。
[0003]目前構(gòu)樹的種苗制備主要靠扦插和組培苗供應(yīng)。扦插存在著季節(jié)性、場地占用面積大、效率低等問題。常規(guī)組培方法存在著人工成本高、勞動量大、成本高等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種制備構(gòu)樹體細(xì)胞胚的方法及其在構(gòu)樹擴繁中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明提供了一種制備構(gòu)樹體細(xì)胞胚的方法(方法甲)，包括如下步驟:
[0006]( I )取構(gòu)樹無菌苗的葉片，切成0.5X0.5cm2，接種到培養(yǎng)基甲上，23±2°C黑暗培養(yǎng)25天；
[0007]( II )取步驟(I )得到的胚性愈傷組織，接種到所述培養(yǎng)基甲上，23±2°C黑暗培養(yǎng)25天；
[0008](III)取步驟(II )得到的胚性愈傷組織，接種到所述培養(yǎng)基甲上，23±2°C黑暗培養(yǎng)25天；
[0009](IV)將Ig步驟(III)得到的胚性愈傷組織加至1ml培養(yǎng)基乙中，23±2°C、黑暗、10rpm振蕩培養(yǎng)25天；
[0010]( V )完成步驟(IV )后，將I體積份培養(yǎng)體系與I體積份所述培養(yǎng)基乙混合，23±2°C、黑暗、10rpm振蕩培養(yǎng)25天；
[0011](VI)完成步驟(V )后，將I體積份培養(yǎng)體系與I體積份所述培養(yǎng)基乙混合，23±2°C、黑暗、10rpm振蕩培養(yǎng)25天；
[0012](VE)完成步驟(VI)后，將I體積份培養(yǎng)體系與I體積份所述培養(yǎng)基乙混合，23±2°C、黑暗、10rpm振蕩培養(yǎng)25天；
[0013](麗)完成步驟(VE)后，將I體積份培養(yǎng)體系與I體積份所述培養(yǎng)基乙混合，23±2°C、黑暗、10rpm振蕩培養(yǎng)25天；
[0014](IX)將I體積份步驟(VID)得到的培養(yǎng)體系與2體積份培養(yǎng)基丙混合，23±2°C、12小時光照/12小時黑暗、10rpm振蕩培養(yǎng)30天；
[0015]所述培養(yǎng)基甲為含0.5mg/L 2，4_ 二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5g/L瓊脂粉的MS培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基乙為含0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和3(^/1蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基丙為含 0.5mg/L NAA,0.2mM TDZ、0.4mg/L IBA、0.4mg/L 6-BA 和 30g/L 蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基。
[0016]步驟(IX )中，所述光照的條件可為1500-20001x，具體可為15001x。
[0017]本發(fā)明還提供了另一種制備構(gòu)樹體細(xì)胞胚的方法(方法乙)，包括如下步驟:
[0018](I)將構(gòu)樹的胚性愈傷組織加至培養(yǎng)基乙中進行培養(yǎng)；所述培養(yǎng)基乙為含0.5mg/L 2，4- 二氯苯氧乙酸和30g/L蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基；
[0019](2)完成步驟(I)后，將培養(yǎng)體系轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基丙中進行培養(yǎng)；所述培養(yǎng)基丙為含0.5mg/L NAA,0.2mM TDZ、0.4mg/L IBA、0.4mg/L 6-BA 和 30g/L 蔗糖的 1/2MS 培養(yǎng)基。
[0020]方法乙中，所述構(gòu)樹的胚性愈傷組織的制備方法如下:取構(gòu)樹的外植體，接種到培養(yǎng)基甲上，進行培養(yǎng)；所述培養(yǎng)基甲為含0.5mg/L 2，4- 二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5g/L瓊脂粉的MS培養(yǎng)基。
[0021]方法乙中，所述構(gòu)樹的胚性愈傷組織的制備方法如下:
[0022]①取構(gòu)樹的外植體，接種到培養(yǎng)基甲上，培養(yǎng)；
[0023]②取步驟①得到的胚性愈傷組織，接種到所述培養(yǎng)基甲上，培養(yǎng)；
[0024]③取步驟②得到的胚性愈傷組織，接種到所述培養(yǎng)基甲上，培養(yǎng)；
[0025]所述培養(yǎng)基甲為含0.5mg/L 2，4_ 二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5g/L瓊脂粉的MS培養(yǎng)基。
[0026]所述構(gòu)樹的外植體為構(gòu)樹無菌苗的葉或構(gòu)樹無菌苗的莖。所述構(gòu)樹的外植體具體如下:取構(gòu)樹無菌苗的葉片，切成0.5X0.5cm2。所述構(gòu)樹的外植體具體如下:取構(gòu)樹無菌苗的莖，切成Icm的莖段。
[0027]①、②和③中，所述培養(yǎng)的條件均為:23±2°C黑暗培養(yǎng)25天。
[0028]所述步驟(I)具體包括如下步驟:
[0029](1-1)將Ig構(gòu)樹的胚性愈傷組織加至1ml所述培養(yǎng)基乙中，23±2 °C、黑暗、10rpm振蕩培養(yǎng)25天；
[0030](1-2)完成步驟(1-1)后，將I體積份培養(yǎng)體系與I體積份所述培養(yǎng)基乙混合，23±2°C、黑暗、10rpm振蕩培養(yǎng)25天；
[0031](1-3)完成步驟(1-2)后，將I體積份培養(yǎng)體系與I體積份所述培養(yǎng)基乙混合，23±2°C、黑暗、10rpm振蕩培養(yǎng)25天；
[0032](1-4)完成步驟(1-3)后，將I體積份培養(yǎng)體系與I體積份所述培養(yǎng)基乙混合，23±2°C、黑暗、10rpm振蕩培養(yǎng)25天；
[0033](1-5)完成步驟(1-4)后，將I體積份培養(yǎng)體系與I體積份所述培養(yǎng)基乙混合，23±2°C、黑暗、10rpm振蕩培養(yǎng)25天。
[0034]所述步驟(2)中，所述培養(yǎng)的條件為:23±2°C、12小時光照/12小時黑暗、振蕩培養(yǎng)30天。
[0035]所述步驟⑵中，培養(yǎng)體系和所述培養(yǎng)基丙的配比為:
[0036]I體積份培養(yǎng)體系:2體積份培養(yǎng)基丙。
[0037]所述步驟(2)中，所述振蕩培養(yǎng)具體可為10rpm振蕩培養(yǎng)。
[0038]所述步驟(2)中，所述光照的條件可為1500-20001x，具體可為15001x。
[0039]本發(fā)明還保護一種擴繁構(gòu)樹的方法，包括如下步驟:將以上任一所述方法制備得到的構(gòu)樹體細(xì)胞胚放入海藻酸鈉溶液中并室溫浸泡3-4min，然后轉(zhuǎn)移至0.5g/100mL水CaCl2溶液中并室溫浸泡3min，得到人工種子；
[0040]將所述人工種子置于培養(yǎng)基丁上，24°C、12小時光照/12小時黑暗、靜置培養(yǎng)30d ；
[0041]所述培養(yǎng)基丁為含0.5mg/L NAA+0.5mg/L 6_BA、lmg/L GA3、30g/L 鹿糖和 7g/L 瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基。
[0042]所述海藻酸鈉溶液中，海藻酸鈉的濃度可為2.0g/100mL-3.5g/100mL。
[0043]所述海藻酸鈉溶液具體如下:將海藻酸鈉溶于1/2MS培養(yǎng)基，得到3.0g/100mL的海藻酸鈉溶液。
[0044]所述光照的條件可為1500-20001x，具體可為15001x。
[0045]本發(fā)明還保護一種制備構(gòu)樹體細(xì)胞胚的試劑盒，由所述培養(yǎng)基甲、所述培養(yǎng)基乙和所述培養(yǎng)基丙組成。
[0046]本發(fā)明還保護一種擴繁構(gòu)樹的試劑盒，由所述培養(yǎng)基甲、所述培養(yǎng)基乙、所述培養(yǎng)基丙和所述培養(yǎng)基丁組成。
[0047]本發(fā)明中，首先利用構(gòu)樹無菌苗的愈傷組織建立懸浮體細(xì)胞胚培養(yǎng)體系并優(yōu)化培養(yǎng)條件，可以短時間內(nèi)獲得大量體細(xì)胞胚，進一步將體細(xì)胞胚制備為人工種子，再進一步培育人工種子得到了構(gòu)樹幼苗。本發(fā)明首次完成了構(gòu)樹從外植體高效誘導(dǎo)體細(xì)胞并液體懸浮培養(yǎng)的整個技術(shù)體系，為大規(guī)模工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)，解決了構(gòu)樹種苗制備繁瑣和市場緊缺的問題。
【具體實施方式】
[0048]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。本實施例中所用的構(gòu)樹為大連中植環(huán)境生物科技有限公司培育的快活林品牌雜交構(gòu)樹。
[0049]實施例1、制備體細(xì)胞胚
[0050]1、制備胚性愈傷組織
[0051](I)取構(gòu)樹無菌苗的葉片，切成0.5X0.5cm2，接種到培養(yǎng)基甲上，23±2°C黑暗培養(yǎng)25天。此時可以觀察到從葉片切口處生長出淺黃色愈傷組織，即胚性愈傷組織。
[0052](2)取步驟⑴得到的胚性愈傷組織，接種到培養(yǎng)基甲上，23±2°C黑暗培養(yǎng)25天。
[0053](3)取步驟⑵得到的胚性愈傷組織，接種到培養(yǎng)基甲上，23±2°C黑暗培養(yǎng)25天。
[0054]實際操作中，可以持續(xù)按照步驟(2)的方法進行繼代培養(yǎng)。
[0055]培養(yǎng)基甲(固體):含0.5mg/L 2，4_ 二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5g/L瓊脂粉的MS培養(yǎng)基。
[0056]2、液體懸浮培養(yǎng)
[0057](I)將Ig步驟I的⑶得到的胚性愈傷組織加至1ml培養(yǎng)基乙中，23±2°C、黑暗、10rpm振蕩培養(yǎng)25天。
[0058](2)完成步驟⑴后，將I體積份培養(yǎng)體系與I體積份培養(yǎng)基乙混合，23±2°C、黑暗、10rpm振蕩培養(yǎng)25天。
[0059](3)完成步驟⑵后，將I體積份培養(yǎng)體系與I體積份培養(yǎng)基乙混合，23±2°C、黑暗、10rpm振蕩培養(yǎng)25天。
[0060](4)完成步驟(3)后，將I體積份培養(yǎng)體系與I體積份培養(yǎng)基乙混合，23±2°C、黑暗、10rpm振蕩培養(yǎng)25天。
[0061](5)完成步驟⑷后，將I體積份培養(yǎng)體系與I體積份培養(yǎng)基乙混合，23±2°C、黑暗、10rpm振蕩培養(yǎng)25天。
[0062]實際操作中，可以按照步驟(2)的方法進行3-5次繼代培養(yǎng)，得到穩(wěn)定的懸浮細(xì)胞體系。
[0063]培養(yǎng)基乙(液體):含0.5mg/L 2，4_ 二氯苯氧乙酸和30g/L蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基。
[0064]3、制備體細(xì)胞胚
[0065]將I體積份步驟2的(5)得到的培養(yǎng)體系與2體積份培養(yǎng)基丙混合，23±2°C、12小時光照(光照強度為15001x)/12小時黑暗、10rpm振蕩培養(yǎng)30天，此時培養(yǎng)體系中體細(xì)胞胚的濃度大于等于15000個/L。
[0066]培養(yǎng)基丙(液體):含0.5mg/L NAA( α -萘乙酸)、0.2mM TDZ(thidiazuron)、0.4mg/LIBA(3-吲哚丁酸)、0.4mg/L 6-BA (6-芐氨基嘌呤)和30g/L蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基。
[0067]實施例2、體細(xì)胞胚植株再生
[0068]將海藻酸鈉溶于1/2MS培養(yǎng)基，得到海藻酸鈉溶液。
[0069]1、將實施例1得到的體細(xì)胞胚放入3.0g/100mL的海藻酸鈉溶液中并室溫浸泡3-4min，然后轉(zhuǎn)移至0.5g/100mL CaCl2水溶液中并室溫浸泡3min，形成具有一定硬度的人工種子，然后用無菌去離子水沖洗3-4次以終止反應(yīng)，置于無菌紙上吸去人工種子表面水分。
[0070]2、將人工種子置于培養(yǎng)基丁上，24°C、12小時光照(本實施例中的光照強度為15001x ;實際操作中，光照強度為1500-20001x均可)/12小時黑暗、靜置培養(yǎng)30d。
[0071]培養(yǎng)基丁(固體):含 0.5m