提高栽培煙與花煙草雜交親和性和結(jié)籽率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種提高栽培煙與花煙草雜交親和性和結(jié)籽率的方法，屬農(nóng)業(yè)生物技 術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】：
[0002] 植物種間遠(yuǎn)緣雜交可以在一定程度上打破物種間的界限，把兩個(gè)物種經(jīng)過長(zhǎng)期進(jìn) 化積累起來的有益性狀重新組合，以形成新的產(chǎn)量、品質(zhì)性狀和對(duì)病、蟲、寒、旱、澇等脅迫 的抗（耐）性等。遠(yuǎn)緣雜交在小麥、棉花、水稻和番茄等植物生產(chǎn)育種中已經(jīng)發(fā)揮了重要作 用。但在許多作物的雜交育種組合中，種間遺傳背景差異和生殖隔離常導(dǎo)致雜交不親和。這 種現(xiàn)象也普遍存在于煙草屬植物中，包括受精前雜交不親和與受精后雜種不育、雜種不能 存活和雜種衰退，其中雜交不親和包括柱頭不親和、花柱不親和與胚囊不親和。因此研究種 間雜交不協(xié)調(diào)的分子機(jī)制對(duì)提高雜交親和性和推動(dòng)煙草育種工作向前發(fā)展具有重要意義。 重復(fù)授粉、延遲授粉等授粉方法曾被運(yùn)用于小麥、百合和番茄等植物的制種過程中，增加了 結(jié)實(shí)率。近年來，以滅活花粉囊、柱頭、花柱研磨物為介質(zhì)花粉的授粉技術(shù)也被大面積運(yùn)用 于大批量煙草種子生產(chǎn)過程，大大節(jié)約了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率。
[0003] 碧冬煙亞屬的花煙草（N. alata，η = 9)抗病性強(qiáng)，對(duì)野火病、白粉病和番茄斑痿 病等都有很好的抗性。前人曾用常規(guī)授粉方法試圖將Ν. alata的優(yōu)良性狀引入栽培煙草 種，沒有獲得良好結(jié)果，并且對(duì)雜交不親和發(fā)生的時(shí)間、部位和突破雜交不親和的方法沒有 系統(tǒng)研究。我們研究表明：早附〇〇七丨&仙七&匕&〇_(81&.)5寬3.2私(5側(cè)_&加3]^&雜交 過程中，在母本花朵處于始開期授粉，N. alata花粉管生長(zhǎng)受阻而停留在母本花柱基部距子 房0. 81 ±0.1 Ocm處，無法進(jìn)入子房，更無法獲得種子。研究一種可以促使野生煙N. alata 花粉管突破這一障礙的方法，對(duì)于充分利用攜帶重要抗性遺傳資源的N. alata具有重要意 義，也可以進(jìn)一步指導(dǎo)突破具有類似雜交不親和障礙機(jī)制的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)之不足，而提供一種提高栽培煙與花煙草雜交親 和性和結(jié)籽率的方法。
[0005] 本發(fā)明通過調(diào)整授粉時(shí)間和添加柱頭研磨物相結(jié)合，突破N. alata花粉管在母本 Nicotiana tabacum(gla.) S K326(簡(jiǎn)寫為Nta (gla.)SK326)花柱基部阻礙，獲得雜交種子 并提高雜種結(jié)籽率的方法。
[0006] 本發(fā)明的具體步驟如下：
[0007] 1、栽培煙即母本Nta(gla. )SK326花朵剛開放掛牌，掛牌時(shí)間定義為始開期，掛牌 后72h、96h和120h定義為始開期后的衰老階段，在72h、96h和120h的3個(gè)時(shí)間段，用花煙 草即父本N. alata成熟花粉對(duì)母本柱頭授粉；
[0008] 2、選栽培煙即母本Nta(gla.)SK326)始開期花朵，剝?nèi)〈迫锊⒓羧≈^，柱頭在 室內(nèi)自然晾干2天，將柱頭粉碎為粉末，將花煙草即父本N. alata成熟花粉與柱頭粉末按 1:5-1:50的重量比混合；
[0009] 3、用按1:5-1:50的重量比混合的花粉對(duì)栽培煙即母本Nta(gla. )SK326)始開期 72-120h后的花朵授粉，授粉后48h采樣，通過胼胝質(zhì)熒光統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)進(jìn)入子房的花粉管數(shù)目 和結(jié)籽率數(shù)據(jù)，比較花粉對(duì)各時(shí)間段雜交結(jié)籽率的影響。
[0010] 本發(fā)明的有益效果在于：操作簡(jiǎn)單，成本低，易于推廣，為植物種間雜交種的獲得 提供了參考的方法。
【具體實(shí)施方式】：
[0011] 實(shí)施例一：
[0012] 本方法的具體步驟如下：
[0013] 1、延遲授粉克服雜交不親和
[0014] a.選栽培煙即母本Nta (gla. ) SK326)始開期花150朵并掛牌，從掛牌時(shí)開始計(jì)時(shí) 為始開期后〇h，在掛牌后72h、96h和120h分別對(duì)其中的50朵用花煙草即父本N. alata成 熟花粉對(duì)母本柱頭授粉，授粉后用尼龍網(wǎng)袋套袋隔離；
[0015] b.授粉48h后取下尼龍網(wǎng)袋，剝?nèi)〈迫?，將其保存于FAA固定液中，4°C放置2h以 上；用NaoH軟化120min，0. 1 %水溶性苯胺藍(lán)染色2h以上，壓片后在熒光顯微鏡觀察花粉 管生長(zhǎng)狀況，統(tǒng)計(jì)25個(gè)雌蕊中花粉管生長(zhǎng)阻礙部位。結(jié)果表明：120h后授粉有花粉管生長(zhǎng) 進(jìn)入子房的雌蕊數(shù)較72h和96h多，其中72h為6個(gè)，72h為11個(gè)，120h為20個(gè)；
[0016] c.授粉后30天，摘取不同時(shí)間段授粉的果實(shí)，果實(shí)取回后報(bào)紙包好，放于25°C 干燥培養(yǎng)箱中烘干待種子散出，稱取2g各時(shí)間段所獲種子播于土壤中，25°C溫室萌發(fā)10 天，觀察萌發(fā)的種子率，結(jié)果表明：始開期72h、96h和120h后授粉結(jié)籽率分別為0. 01%、 0· 03%和 0· 1%。
[0017] 2、雜交結(jié)籽率的提高
[0018] a.選栽培煙即母本Nta (gla. )SK326)始開期花50朵并掛牌，從掛牌時(shí)開始計(jì)時(shí)為 始開期后〇h，掛牌后120h記為始開期后120h ;
[0019] b.選栽培煙即母本Nta(gla.)SK326)始開期花朵，剝?nèi)〈迫锊⒓羧≈^，柱頭在 室內(nèi)自然晾干2天，將柱頭粉碎為粉末，將花煙草即父本N. alata成熟花粉與柱頭粉末按 1:5,1:10的重量比混合；
[0020] b.用按1:5,1:10的重量比混合的花粉對(duì)栽培煙即母本Nta (gla. )SK326)始開期 后120h的花朵授粉，后續(xù)處理同延遲授粉克服雜交不親和步驟中的b、c步驟。結(jié)果表明： 1:5和1:10混合花粉在始開期120h后授粉，和始開期后120h直接用父本花粉授粉相比，有 花粉管生長(zhǎng)進(jìn)入子房的雌蕊數(shù)和生長(zhǎng)進(jìn)入子房的花粉管數(shù)目均增多，重量比1:5,1:10混 合花粉結(jié)籽率分別為〇. 9 %和1. 65%。
[0021] 實(shí)施例二：
[0022] 雜交結(jié)籽率的提高，始開期后120h延遲授粉的方法同實(shí)施例一，不同之處在于柱 頭研磨物和父本的花粉比例。
[0023] a.選栽培煙即母本Nta(gla.)SK326)始開期花朵，剝?nèi)〈迫锊⒓羧≈^，柱頭在 室內(nèi)自然晾干2天，將柱頭粉碎為粉末，將花煙草即父本N. alata成熟花粉與柱頭粉末按 1:20和1:50的重量比混合；
[0024] b.用按1:20,1:50的重量比混合的花粉對(duì)栽培煙即母本Nta(gla. )SK326)始開期 后120h的花朵授粉，后續(xù)處理同實(shí)施例一中延遲授粉克服雜交不親和步驟中的b、c步驟。 結(jié)果表明：1:5和1:10混合花粉在始開期120h后授粉，和始開期后120h直接用父本花粉 授粉相比，有花粉管生長(zhǎng)進(jìn)入子房的雌蕊數(shù)和生長(zhǎng)進(jìn)入子房的花粉管數(shù)目均增多，重量比 1:20,1:50混合花粉授粉后結(jié)籽率分別為1. 75%和1. 3%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種提高栽培煙與花煙草雜交親和性和結(jié)籽率的方法，其特征在于該方法的具體步 驟如下： a. 栽培煙即母本花朵剛開放掛牌，掛牌時(shí)間定義為始開期，掛牌后72h、96h和120h定 義為始開期后的衰老階段，在72h、96h和120h的3個(gè)時(shí)間段，用花煙草即父本成熟花粉對(duì) 母本柱頭授粉，通過胼胝質(zhì)熒光統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)進(jìn)入子房的花粉管數(shù)目和結(jié)籽率數(shù)據(jù)，比較不同 時(shí)間段授粉對(duì)雜交親和性的影響； b. 選栽培煙即母本始開期花朵，剝?nèi)〈迫锊⒓羧≈^，柱頭在室內(nèi)自然晾干2天，將柱 頭粉碎為粉末，將花煙草即父本成熟花粉與柱頭粉末按1:5-1:50的重量比混合； c. 用按1:5-1:50的重量比混合的花粉對(duì)栽培煙即母本始開期后120h的花朵授粉，授 粉后48h采樣，通過胼胝質(zhì)熒光統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)進(jìn)入子房的花粉管數(shù)目和結(jié)籽率數(shù)據(jù)，比較不同 比例的混合花粉對(duì)雜交結(jié)籽率的影響。
【專利摘要】提高栽培煙與花煙草雜交親和性和結(jié)籽率的方法，屬農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。方法為：母本花朵開放掛牌，掛牌時(shí)間為始開期，掛牌后72h、96h和120h為始開期后的衰老階段，在這3個(gè)時(shí)間段，用父本成熟花粉對(duì)母本柱頭授粉，授粉48h后采樣，用胼胝質(zhì)熒光統(tǒng)計(jì)花粉管數(shù)目和結(jié)籽率，比較授粉對(duì)雜交親和性的影響；選母本始開期花朵，剝?nèi)〈迫锊⒓羧≈^，柱頭在室內(nèi)自然晾干2天后碎為粉末，將父本成熟花粉與柱頭粉末按1:5-1:50的重量比混合；用混合的花粉對(duì)母本始開期后120h的花朵授粉，授粉48h后采樣，用胼胝質(zhì)熒光統(tǒng)計(jì)花粉管數(shù)目和結(jié)籽率，比較混合花粉對(duì)雜交結(jié)籽率的影響；栽培煙為母本，花煙草為父本。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，成本低，易推廣，為植物種間雜交種的獲得提供了參考。
【IPC分類】A01H1/02
【公開號(hào)】CN104996295
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510449640
【發(fā)明人】陳穗云, 廖菊夠, 李永平, 馬文廣
【申請(qǐng)人】云南大學(xué)
【公開日】2015年10月28日
【申請(qǐng)日】2015年7月28日