基于多節(jié)間莖段一體化培育黃花倒睡蓮組培苗方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于植物栽培領域，具體涉及一種基于多節(jié)間莖段一體化培育黃花倒睡蓮組培苗方法。
【背景技術】
[0002]黃花倒睡蓮iPolygala /aWax Hemsl.)又名黃花參、雞仔樹、吊吊黃、黃花吊水蓮、觀音串、黃花大遠志，遠志科(Polygalaceae)遠志屬、Polygala)植物。主要分布廣西、福建、湖南等地，生于山坡疏林下或溝谷叢林中，屬珍貴中藥材。黃花倒睡蓮的根或全草，是瑤、苗、壯等少數(shù)民族常用的民間藥物，具有補益、強壯、祛濕、散疲之功效，治療虛弱虛腫，急慢性肝炎，腰腿酸痛，跌打損傷。近年來，黃花倒睡蓮的藥用價值逐漸被重視，但關于繁殖與藥用價值開發(fā)方面的研究并不多，更因早被民間所認知，市場需求量大，而野生資源有限，導致黃花倒睡蓮資源嚴重短缺。應該在資源保護基礎上，開展擴繁、引種、栽培研究，以擴大藥用資源。近年來，我們開展了黃花倒睡蓮生境分析、扦插、組織培養(yǎng)等快繁及人工栽培技術研究，為實現(xiàn)黃花倒睡蓮的規(guī)?；N植與有效成分的提取奠定基礎。
[0003]黃花倒睡蓮在自然狀態(tài)下通常都用種子繁殖，但繁殖系數(shù)較低，種子成熟后及時采收，清除殘存花柱，晾干。沙藏處理，翌春再播，或直接秋播。但自然狀態(tài)下，受生長海拔、氣候等生態(tài)因素的影響，種子不宜收集，且成活率較低。因此，人們開始尋求通過組織培養(yǎng)、扦插等快速繁殖途徑以緩解資源的壓力。黃花倒睡蓮其組織培養(yǎng)及扦插并不困難，但相關報道尤其是組培再生成苗的報道不多。
[0004]選擇優(yōu)良品種的健壯無病株在春季3-5月間，植株生長旺盛進入開花期進行。但扦插的繁殖系數(shù)相對較小(蔡仕珍，2005)。筆者對黃花倒睡蓮扦插繁殖的研究表明，采用全沙基質1000 ppm吲哚丁酸處理的扦插效果最好，其生根率可達85%以上。此結果比蔡仕珍報道的同屬植物黃花遠志的扦插生根效果更好。
[0005]但以上兩種方法的缺點均為繁殖時間太長，繁殖系數(shù)太小，不能達到大量引種繁殖的需要。
[0006]以當年生黃花倒睡蓮幼嫩帶腋芽莖段作為外植體，開展組織培養(yǎng)試驗研究。結果表明:最佳外植體誘導培養(yǎng)基為1/2 MS + BA 2.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L，誘導率可達95.1%;最佳增殖培養(yǎng)基為WPM + BA 1.5 mg/L + NAA 0.1 mg/L，增殖系數(shù)為6.12，周期為25 d，不定芽生長狀況好；最佳生根培養(yǎng)基為1/2 WPM + IBA 0.1 mg/L + ABT 0.4 mg/L，生根率為95.67% ;以泥炭土:黃泥土:珍珠巖(2:1: I)為移栽基質，移栽成活率可達92.6%，苗木長勢好，葉色綠。(劉秀芳，2012 ;林文革，2012)
現(xiàn)有的種子繁殖、扦插繁殖等繁殖技術均有繁殖時間過長，繁殖倍數(shù)較低等缺點。而現(xiàn)有的組織培養(yǎng)技術用單個莖段誘導單芽，再用單芽誘導叢生芽最后再利用叢生芽誘導成苗的多過程多步驟的方法(林文革，2012)使得黃花倒睡蓮組織培養(yǎng)苗木培育的整個過程時間過長，繁殖系數(shù)過大而導至苗木繼代倍數(shù)過多以及質量大幅下降，加大了黃花倒睡蓮苗木的變異性。本發(fā)明針對現(xiàn)有組織培養(yǎng)技術所存在的問題，提供了一種采用多節(jié)間莖段作為外植體，同時采用專項研究出的獨立配方使其在一代的培養(yǎng)基中完成增殖、生根等過程，利用它們一體化的方法來培育出黃花倒睡蓮組織培養(yǎng)苗。本方法在提高其繁殖系數(shù)的同時，保存了苗木的優(yōu)質性來滿足引種推廣的需求；這種黃花倒睡蓮組織培養(yǎng)技術能在較短的30-50 d內，繁殖出大量具有保持母本優(yōu)良品質的黃花倒睡蓮植株。與常規(guī)種子繁殖、扦插、組培繁殖等繁殖技術相比，此法有效地提高黃花倒睡蓮fallax Hemsl.)的繁殖系數(shù)，保持母本的優(yōu)良性狀，不易產(chǎn)生性狀變異。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供基于多節(jié)間莖段一體化培育黃花倒睡蓮組培苗方法，利用該方法不僅提高了黃花倒睡蓮組培苗的生長速度，縮短生長周期，提高繁殖系數(shù)，而且縮短了生根時間，增加了根系活力，提高了組培成苗的質量，為藥用植物黃花倒睡蓮組培快繁研究提供了一種思路、方法。
[0008]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案:
基于多節(jié)間莖段一體化培育黃花倒睡蓮組培苗方法，取黃花倒睡蓮植株為外植體，經(jīng)過表面消毒、初代培養(yǎng)、一體化培養(yǎng)、煉苗、移栽，最終獲得黃花倒睡蓮組培苗。
[0009]所述方法具體包括以下步驟:
(1)表面消毒:取生長健壯、無病蟲害的野生黃花倒睡蓮植株為外植體，去除葉片后用軟毛刷輕刷表皮，將其進行表面消毒處理a后，切成含有2-4個多節(jié)間的莖段備用；若選擇生長健壯的黃花倒睡蓮組培苗用于繁殖，則采用消毒處理b后直接切取后進行初代培養(yǎng)；
(2)初代培養(yǎng)-叢生芽誘導與增殖:將已經(jīng)過消毒處理的多節(jié)間莖段接種入培養(yǎng)基A中，多節(jié)間莖段橫放平鋪于培養(yǎng)基中，10-15天后進行一體化培養(yǎng)；
(3)—體化培養(yǎng):將經(jīng)初代誘導的多節(jié)間叢生芽切取成1.5-2.0 cm長的單芽橫放入培養(yǎng)基B中，每瓶接種30棵，光照強度為1500-3000 lx, 10天后開始生根，20天長至6_8 cm高度后，準備移栽；
(4)煉苗:20天后，將瓶苗從培養(yǎng)室取出放置常規(guī)室內3-5天，第6天將瓶蓋打開繼續(xù)放置2天，期間每天要補充10-15 ml無菌水至瓶內，第8天后將組培苗輕輕夾出，洗凈根部培養(yǎng)基，以備移栽；
(5)移栽:將洗凈的黃花倒睡蓮組培苗用500ppm多菌靈溶液浸泡30 min后，取出，用稀黃土將其根部包裹成雞蛋大小后，移栽入一定配比組合的泥炭土、黃泥土、珍珠巖等栽培基質中種植；
(6)田間栽培管理:將幼苗移栽田間，環(huán)境溫度24-26°C，噴霧保濕，保持空氣濕度85%-95%，覆蓋遮陰率70%遮陽網(wǎng)，每周噴灑I次廣譜殺菌劑，每月澆I次兩倍MS大量溶液(成分配比見附件I )，一年后植株的平均根粗可達0.5-0.8 cm。
[0010]步驟(I)中表面消毒處理a為在含有體積濃度為0.1-0.2%洗潔精的水中浸泡30min,流動的水沖洗1-2 h，置于超凈工作臺上用70 wt.%酒精消毒20-30 S，無菌水沖洗3_5次，再用0.1 wt.%升萊消毒10-20 min，無菌水沖洗3_5次后，用無菌濾紙吸干外植體表面的水分。
[0011]步驟(I)中消毒處理b為70 wt.%酒精消毒5 s，無菌水沖洗3-5次，0.1 wt.%升汞消毒3 min，無菌水沖洗3-5次后，用無菌濾紙吸干外植體表面的水分。
[0012]培養(yǎng)基A 配方為:MS+ 6BA 1.5 mg/L + NAA 0.05 mg/L + KT 0.5 mg/L + Sue30 g/L + 瓊脂粉 8 g/L, PH 值為 5.8。
[0013]培養(yǎng)基B 配方為:1/4 MS+ IBA 0.2 mg/L + NAA 0.5 mg/L + AC I g/L + Sue 20g/L +瓊脂粉9 g/L, PH值為5.9。
[0014]所述的移栽基質配比是:泥炭土:黃泥土:珍珠巖的重量比為3:2:1。
[0015]所述廣譜殺菌劑為50%多菌靈與70%甲基托布津交替使用。
[0016]附件I
MS培養(yǎng)基中的成份為(單位mg/L):
(一)、大量元素:
1、硝酸鉀 KNO31900 ；2、硝酸銨 NH4NO31650 ；
3、磷酸二氫鉀 KH2PO4 170 ；4、硫酸鎂 MgSO4.7H20 370 ；
5、氯化鈣CaCl2.2H20 440 ；
(二)、微量元素:
6、碘化鉀KI0.83 ； 7、硼酸 H3BO36.2 ；
8、硫酸錳 MnSO4.4H20 22.3 ； 9、硫酸鋅 ZnSO4.7H20 8.6 ；
10、鉬酸鈉 Na2MoO4.2H20 0.25 ； 11、硫酸銅(:11504.5!120 0.025;
12、氯化鉆CoCl2.6H20 0.025;
(三)、鐵鹽:
13、乙二胺四乙酸二鈉Na2-EDTA 37.3 ； 14、硫酸亞鐵 FeSO4.7H20 27.8 ；
(四)、有機成分:
15、肌醇100;16、甘氨酸2.0;
17、鹽酸硫胺素(VB1) 0.1;18、鹽酸吡哆醇(VB6) 0.5;
19、煙酸(VB3)0.5 ；
1/4MS的成分為:大量兀素是MS培養(yǎng)基大量兀素的四分之一，其余成分與MS培養(yǎng)基相同。
[0017]6BA:6-芐基腺嘌呤；NAA:萘乙酸；KT:激動素；
2，4-D:2, 4- 二氯苯氧乙酸；AC:活性炭。
[0018]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
本方法在傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)的方法的基礎上，利用所研究的專項培養(yǎng)基配方來一體化培育黃花倒睡蓮組培苗，解決了原本傳統(tǒng)的分步驟誘導的組織培養(yǎng)方法存在的培育周期過長，階段過多，轉接次數(shù)過多以及實驗材料易被污染等問題。
[0019]本發(fā)明所用的外植體為黃花倒睡蓮多節(jié)間莖段，并通過專項實驗研究設計的繁芽、增殖、生根一體化的一次性組織培養(yǎng)誘導方法來獲得黃花倒睡蓮再生植株，按本發(fā)明所培育的黃花倒睡蓮植株生根成苗率為100%，移栽成活率為95%以上。本方法中黃花倒睡蓮的組培成苗時間僅為30-50 d，提高黃花倒睡蓮的繁殖倍數(shù)的同時提高了黃花倒睡蓮的組培苗成活率更高，降低了黃花倒睡蓮組織培養(yǎng)技術的生產(chǎn)成本，為黃花倒睡蓮的開發(fā)利用及產(chǎn)業(yè)化推廣提供了新的技術。
【具體實施方式】
[0020]實施例1
(1)表面消毒:取生長健壯、無病蟲害的野生黃花倒睡蓮植株為外植體，去除葉片后用軟毛刷輕刷表皮，將其進行表面消毒處理a后，切成含有3個多節(jié)間的莖段備用；
(2)初代培養(yǎng)-叢生芽誘導與增殖:將已經(jīng)過消毒處理的多節(jié)間莖段接種入培養(yǎng)基A中，多節(jié)間莖段橫放平鋪于培養(yǎng)基中，15天后進行一體化培養(yǎng)；
(3)—體化培養(yǎng):將經(jīng)初代誘導的多節(jié)間叢生芽切取成2.0 cm長的單芽橫放入培養(yǎng)基B中，每瓶接種30棵，光照強度為3000 lx, 10天后開始生根，20天后長至8 cm高度后，準備移栽;
(4)煉苗:20天后，將瓶苗從培養(yǎng)室取出放置常規(guī)室內5天，第6天將瓶蓋打開繼續(xù)放置2天，期間每天要補充15 ml無菌水至瓶內，第8天后將組培苗輕輕夾出，洗凈根部培養(yǎng)基，以備移栽；
(5)移栽:將洗凈的黃花倒睡蓮組培苗用500ppm多菌靈溶液浸泡30 min后，取出，將其用沾水的黃土裹根，