一種黃精的組培快繁方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黃精的組培快繁方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃精為百合科植物黃精（POlygonatumsibircum Red ·)、多花黃精（P. Cyrtonema Hua)或滇黃精（P. KingianumColl. etHemsl.)的干燥根莖。按藥材形狀不同，習(xí)稱"雞頭黃 精"，"姜形黃精"。黃精性平，味甘。具補(bǔ)脾潤肺、益氣養(yǎng)陰之功效。黃精主產(chǎn)于河北、內(nèi)蒙 古、陜西省等省區(qū)。多花黃精主產(chǎn)于貴州、湖南、云南、安徽、浙江等省。滇黃精主產(chǎn)于貴州、 廣西、云南等省區(qū)。
[0003] 黃精為藥食兩用藥材，市場前景廣闊，加之新藥研制和保健品開發(fā)，人們對黃精的 需求量也與日倶增，野生資源不能滿足生產(chǎn)需要。近年來很多地方開始規(guī)范化人工栽培研 究，但主要是用塊莖進(jìn)行無性繁殖，繁殖系數(shù)低，種子繁殖周期也較長，限制了黃精的生產(chǎn) 規(guī)模。利用植物組織培養(yǎng)方法建立黃精的快速繁殖體系是生產(chǎn)黃精優(yōu)質(zhì)種苗和栽培推廣的 有效途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種黃精的組培快繁方法，可以加快黃精的繁殖速度，建 立起黃精的快速繁殖體系，是生產(chǎn)黃精優(yōu)質(zhì)種苗和栽培推廣的有效途徑。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0006] -種黃精的組培快繁方法，包括如下步驟：
[0007] (1)外植體的選擇與消毒：選取帶芽根莖作為外植體，去掉根系，剝離葉包片，切 取頂芽用流水沖洗lh，將頂芽晾干后在超凈工作臺上用75%酒精浸泡15~20s，用無菌水 沖洗3~5次后，放入0. 2 %的HgCl2溶液中，輕搖5~8min后取出，再用無菌水沖洗5~ 7次；
[0008] (2)接種培養(yǎng)：將經(jīng)過消毒的外植體的頂芽接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng) 30~35d誘導(dǎo)出帶芽組織；
[0009] (3)增殖培養(yǎng)：將誘導(dǎo)成功的帶芽組織每個切成5~8份，然后轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基 上進(jìn)行35~40d的增殖培養(yǎng)，由帶不定芽的團(tuán)塊增殖同時分化出芽；
[0010] (4)生根培養(yǎng)：待增殖培養(yǎng)分化得到的小芽苗長到2~4cm時，轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上 誘導(dǎo)分化生根，經(jīng)過45d后長出3~6條根，根長達(dá)1~2cm ;
[0011] (5)煉苗移栽：當(dāng)90%以上芽苗的根長到3根以上、長度彡Icm時，即可進(jìn)行煉苗， 具體為煉苗開始的最初1~2d培養(yǎng)瓶瓶口先敞開一半，然后瓶口全敞開2~3d，選擇具有 3條以上健壯根的小苗，用鑷子小心取出，然后用清水洗掉瓊脂，將小苗移栽到煉苗大棚中 育苗盤的育苗基質(zhì)中，用土覆蓋輕壓，栽好后用噴霧器噴水潤濕，最后進(jìn)行馴化，通風(fēng)，遮陰 管理，煉苗時間為20-30d，即可移栽。
[0012] 前述黃精的組培快繁方法中，進(jìn)行步驟（4)所述生根培養(yǎng)之前，換瓶重復(fù)步驟（3) 所述增殖培養(yǎng)，以獲取更多芽塊。
[0013] 前述黃精的組培快繁方法中，步驟⑵所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA2. 5mg/ 1+NAA0. 2mg/l+KTl. Omg/1+ 蔗糖 25g/l+ 瓊脂 5g/l，其 pH 值為 5. 8 ~6. 0 ;培養(yǎng)條件為：溫 度26°C，光照強(qiáng)度1800~22001x，光照時間為14h/d ;優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值為 6. 0 ;培養(yǎng)條件中的光照強(qiáng)度為20001x。
[0014] 前述黃精的組培快繁方法中，步驟（3)所述的增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA2. Omg/ 1+NAA0. 2mg/l+KTl. Omg/1+蔗糖 25g/l+瓊脂 5g/l，其 pH 值為 6. 0 ;培養(yǎng)條件為：溫度 26°C， 光照強(qiáng)度20001x，光照時間為14h/d。
[0015] 前述黃精的組培快繁方法中，步驟（4)所述的生根培養(yǎng)基為MS+NAA1. Omg/ 1+IBA0. 5mg/l+蔗糖25g/l+瓊脂5g/l，其pH值為6. 0 ;培養(yǎng)條件為：溫度26°C，光照強(qiáng)度 20001x，光照時間為14h/d。
[0016] 前述黃精的組培快繁方法中，步驟（5)所述煉苗大棚內(nèi)溫度控制在20~30°C，相 對濕度控制在75%~85%之間。
[0017] 前述黃精的組培快繁方法中，步驟（5)所述的育苗基質(zhì)為：河沙、草木灰和泥炭土 按照1:1:1的體積比進(jìn)行混合的混合物。
[0018] 為了確保本發(fā)明的有益效果，申請人進(jìn)行了一系列的實(shí)驗，具體如下：
[0019] 一、外植體的選擇
[0020] 選擇黃精的頂芽和新發(fā)的幼嫩塊莖作為外植體進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件一致為溫 度26°C，光照強(qiáng)度為20001x，光照時間為14h/d ;培養(yǎng)基為MS+6-BA2. 5mg/l+NAA0. 2mg/ 1+KT1. Omg/1+蔗糖25g/l+瓊脂5g/l，其pH值為5. 8 ;就其增殖率和不定芽首現(xiàn)日進(jìn)行對 比，結(jié)果見表1。從對比結(jié)果可見，選擇頂芽作為外植體，與幼嫩塊莖作為外植體相比，其增 殖率較高，不定芽首現(xiàn)日較早。
[0021 ] 表1不同外植體對比 [0022]
[0023]
[0024] 二、HgCl2濃度的選擇
[0025] 將取(：12除菌液三種濃度0. 1%，0. 2%，0. 3%以及不同除菌時間進(jìn)行對比，我們發(fā) 現(xiàn)選擇〇. 2 %濃度5min時最佳，雜菌污染最低，濃度過高和時間過長同時也會殺死黃精組 織，降低成活率。
[0026] 三、激素種類及濃度的選擇
[0027] (1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基：采取誘導(dǎo)增殖分化出不定芽，培養(yǎng)時設(shè)計了 MS培養(yǎng)基中添加蔗 糖25g/l和瓊脂5g/l，然后就不同激素及其配比進(jìn)行對比試驗，具體分別為：
[0028] Al, ΝΑΑ0. 1+KT1. 0 ；
[0029] A2, ΝΑΑ0. 2+KT1. 0 ；
[0030] A3, NAAO. 3+KT1. 0 ;
[0031] A4,6-BA2. O+NAAO. 2+KT1. O ;
[0032] A5,6-BA2. 5+NAAO. 2+KT1. O ;
[0033] A6,6-BA2. 5+NAAO. 2+KT2. O ;
[0034] A7,6-BA2. 5+NAAO. I ;
[0035] A8,6-BA2. 5+NAAO. 2 ;
[0036] A9，6-BA2. 5+NAAO. 3。
[0037] 以上單位均為mg/1，通過試驗我們發(fā)現(xiàn)，KT和6-BA對于組織的增殖作用明顯，A2 不定芽首現(xiàn)日早但是分化率和增殖倍數(shù)相對低，A5和A6分化增殖較高，但A6分化低于A5， 其中A5分化增殖最佳，芽的分化率達(dá)10. 8。說明相對濃度為2. 5mg/l的6-BA有利于組織 增殖和芽的快速分化。
[0038] (2)增殖培養(yǎng)基：叢芽的增殖分化培養(yǎng)選擇MS培養(yǎng)基添加蔗糖25g/l和瓊脂5g/ 1，對不同激素濃度進(jìn)行對比試驗，具體為：
[0039] BL6-BA1. O+NAAO. 2+KT1. 0 ；
[0040] B2,6-BA2. O+NAAO. 2+KT1. 0 ;
[0041] B3,6-BA3. O+NAAO. 2+KT1. 0 ；
[0042] B4,6-BA2. 0+ΝΑΑ0. 2+KT2. 0 ;
[0043] B5,6-BA2. 5+NAAO. 2+KT2. 5 ;
[0044] B6,6-BA3. 0+ΝΑΑ0. 2+KT2. 0 ;
[0045] 我們發(fā)現(xiàn)，6-BA濃度越高增殖倍數(shù)越高，但當(dāng)達(dá)到3. 0mg/l時，增殖倍數(shù)反而降 低，B2和B6的發(fā)生周期相對較短，分別為35. 8d和35. 6d，以B2增殖倍數(shù)為5. 58,發(fā)生周 期35. 8d為最佳。
[0046] (3)生根培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基添加蔗糖25g/l和瓊脂5g/l，然后分別添加（0· 1，0· 3， 0.5,0.8)mg/l IBA和（0.6,0.8，1.0，1.2)mg/l NAA進(jìn)行對比，通過試驗發(fā)現(xiàn)，在一定范圍 內(nèi)IBA和NAA的濃度對其根的發(fā)生率和根條數(shù)有顯著影響，分別以0. 5mg/L IBA和1.0 mg/ L NAA最佳，生根率達(dá)95%，而兩者對根長數(shù)影響均不顯著。
[0047] 四、育苗基質(zhì)的選擇
[0048] 移栽煉苗我們選取不同基質(zhì)配比進(jìn)行對比，具體如下：
[0049] Dl :泥炭土 ：河沙=2:1 ;
[0050] D2 :草木灰：河沙=2:1 ;
[0051] D3 :泥炭土 ：草木灰：河沙=1: 1:1 ;
[0052] 將小苗移栽入上述三種基質(zhì)中，大棚內(nèi)溫度控制在20~30 °C，相對濕度在75 %~ 85%之間，30d后我們發(fā)現(xiàn)D2組的成活率相對較低，為70. 5%，Dl與D3的成活率均達(dá)91 % 以上，新根發(fā)生率分別為84%和95%，所以優(yōu)選D3為育苗基質(zhì)。
[0053] 本發(fā)明的有益效果是：
[0054] 本發(fā)明利用植物組織培養(yǎng)方法建立了黃精的快速繁殖體系，是生產(chǎn)黃精優(yōu)質(zhì)種苗 和栽培推廣的有效途徑。
[0055] 本發(fā)明對黃精繁殖過程中用到的各種培養(yǎng)基、用量和培養(yǎng)條件進(jìn)行了試驗篩選和 優(yōu)化，有效的提高了黃精的繁殖系數(shù)。
[0056] 本發(fā)明培養(yǎng)過程速度快，再生頻率較高，變異率較低，周期相對較短，能較好地保 持黃精的遺傳穩(wěn)定性。
【具體實(shí)施方式】
[0057] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0058] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0059] 實(shí)施例1
[0060] 一種黃精的組培快繁方法，包括如下步驟：
[0061] (1)外植體的選擇與消毒：選取帶芽根莖作為外植體，去掉根系，剝離葉包片，切 取頂芽用流水沖洗lh，將頂芽晾干后在超凈工作臺上用75%酒精浸泡15s，用無菌水沖洗3 次后，放入0. 2%的HgCU容液中，輕搖5min后取出，再用無菌水沖洗5次；
[0062] (2)接種培養(yǎng)：將經(jīng)過消毒的外植體的頂芽接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS+6-BA2. 5mg/ 1+NAA0. 2mg/l+KTl. Omg/1+蔗糖25g/l+瓊脂5g/l，pH值調(diào)至5. 8)上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件 為：溫度26°C，光照強(qiáng)度18001x，光照時間為14h/d ;培養(yǎng)30d左右