一種楸樹(shù)的體外培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物的體外培養(yǎng)方法，特別是一種楸樹(shù)的體外培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]揪樹(shù){Catalpabungei C.A.Mey)屬紫葳科(Bignoniaceae)梓屬(Caia力?a)的高大喬木，是起源我國(guó)的鄉(xiāng)土樹(shù)種，分布范圍東起海濱，西至甘肅，南始云南，北到長(zhǎng)城的廣大區(qū)域內(nèi)。該樹(shù)種適應(yīng)性強(qiáng)，分布廣，素有“木王”之稱(王文采等1990)。樹(shù)姿俊秀，高大挺拔，花多蓋冠，其花形若鐘，紅斑點(diǎn)綴白色花冠，每至花期，繁花滿枝，是我國(guó)歷史上著名園林觀賞樹(shù)種，自古以來(lái)就種植于皇家庭院、古剎寺廟和風(fēng)景名勝等地，同時(shí)楸樹(shù)還是優(yōu)良的藥用和用材樹(shù)種，具有很高的生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益。此外，楸樹(shù)的環(huán)保性能較強(qiáng)，可消聲，滯塵，有效吸收二氧化硫、氯氣等有毒氣體。因此提高楸樹(shù)的種植面積和利用效益意義極其重大。
[0003]由于楸樹(shù)木材具有諸多其它樹(shù)種不可替代的優(yōu)良特性，加劇了人們對(duì)它的開(kāi)發(fā)利用，自然分布面積不斷縮小，數(shù)量的急劇減少。又因?yàn)殚睒?shù)花而不實(shí)，不同無(wú)性系經(jīng)昆蟲(chóng)傳粉，即使能結(jié)實(shí)，結(jié)實(shí)量也很少(郭從儉1988)。實(shí)生繁殖困難，自古以來(lái)人們一直延用“取傍生者植之”的方法繁衍楸樹(shù)，代代相傳形成了楸樹(shù)的單一無(wú)性系，使楸樹(shù)的發(fā)展受到很大限制。目前楸樹(shù)資源日趨減少，已瀕于“臨危植物”的邊緣，亟待拯救。楸樹(shù)資源的大量毀滅，給人們帶來(lái)嚴(yán)重的不良后果。當(dāng)前已造成材種比例結(jié)構(gòu)失調(diào)，直接影響到國(guó)民經(jīng)濟(jì)建設(shè)和人民的生產(chǎn)生活。因此，迅速恢復(fù)楸樹(shù)生產(chǎn)，大力發(fā)展楸樹(shù)已成為林業(yè)生產(chǎn)的當(dāng)務(wù)之急。
[0004]楸樹(shù)傳統(tǒng)繁殖方法主要采用播種、埋根、嫁接、扦插等方法。而采用這些方法存在實(shí)生苗生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，果實(shí)收集困難，種子發(fā)芽率低，出苗率不穩(wěn)定等缺陷，無(wú)法滿足生產(chǎn)和市場(chǎng)的需求(韓創(chuàng)舉等2006)。因此，探索快速繁殖楸樹(shù)的有效途徑成為亟待解決的問(wèn)題。組織培養(yǎng)具有需要材料量少、繁殖快、不受季節(jié)影響等特點(diǎn)，是快速繁殖木本植物一個(gè)重要方法。近年來(lái)，對(duì)于楸樹(shù)的組織培養(yǎng)研究主要側(cè)重于用幼嫩的莖尖、帶芽點(diǎn)的嫩莖做外植體誘導(dǎo)腋芽(孟永紅等2004;傅玉蘭等2009;聶琳2011)和不定芽(王軍輝等2011)。主要研究了培養(yǎng)基的種類、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的組合和配比、碳源、蔗糖濃度和瓊脂濃度對(duì)腋芽和不定芽的誘導(dǎo)影響。楊燕(楊燕2008)，Lin juan (Lin et al.2010)等探究了不同的激素濃度和不同的外植體對(duì)楸樹(shù)愈傷組織的影響。于永明(于永明等2012)等報(bào)道基因型也是楸樹(shù)腋芽誘導(dǎo)、增殖和生根的主要影響因素。但楸樹(shù)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究還未見(jiàn)報(bào)道，因此建立穩(wěn)定高頻率發(fā)生楸樹(shù)體細(xì)胞胚胎再生體系，為楸樹(shù)的生物技術(shù)育種、種質(zhì)資源保存、快速繁殖、遺傳轉(zhuǎn)化、人為控制楸樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育研究提供良好的實(shí)驗(yàn)體，具有十分重要的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種利用楸樹(shù)體細(xì)胞胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)的方法，其方法的培育周期在I 7 5天左右、再生植株成活率達(dá)到85%以上。
[0006]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案:楸樹(shù)的體外培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
1)愈傷組織的誘導(dǎo):以經(jīng)滅菌的楸樹(shù)為外植體，將其置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織；所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了 6-芐基腺嘌呤(6-BA)和 2，4- 二氣苯氧乙酸(2，4-D)；
2)愈傷組織的增殖:將愈傷組織置于增殖培養(yǎng)基上增殖；所述增殖培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了濃度為0-2.0 mg/L的6-芐基腺嘌呤出-BA)和濃度為0-0.lmg/L 的 α -萘乙酸(NAA)；
3)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及體細(xì)胞胚的分化:將增殖后的愈傷組織置于分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)胚性愈傷組織，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了濃度為0-1.0 mg/L的6-芐基嘌呤出-BA)和濃度為
0-0.1 mg/L 的 α -萘乙酸(NAA)；
4)植株再生:將分化出的體細(xì)胞胚胎置于再生培養(yǎng)基上誘導(dǎo)體胚萌發(fā)，得到楸樹(shù)再生苗；所述植株再生培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基。
[0007]進(jìn)一步講，所述步驟I)中的外植體為未成熟的子葉胚。
[0008]進(jìn)一步講，所述方法步驟I)中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中6-芐基嘌呤(6-ΒΑ)的濃度為 0-2.0 mg/L, 2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)的濃度為 0-2.0 mg/L。
[0009]進(jìn)一步講，所述步驟I)中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中6-芐基嘌呤出-BA)的濃度為0.lmg/L，2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的濃度為 1.0 mg/L。
[0010]進(jìn)一步講，所述方法步驟2)增殖培養(yǎng)基中6-芐基嘌呤(6-BA)的濃度為1.0mg/L，α -萘乙酸(NAA)的濃度為0.0 lmg/L ;
所述方法步驟3)分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中6-芐基嘌呤出-BA)的濃度為0.2mg/L，α -萘乙酸(NAA)的濃度為0.05mg /L0
[0011]進(jìn)一步講，未成熟子葉胚進(jìn)行滅菌的方法為:取楸樹(shù)未成熟細(xì)長(zhǎng)蒴果，用75%酒精棉球擦拭消毒，套剝?nèi)ス?，然后?%的NaClO對(duì)種子進(jìn)行表面消毒4min，無(wú)菌水清洗，40C環(huán)境下保存10小時(shí)以上；再用2%的NaClO浸泡3min，無(wú)菌水清洗，剝?nèi)シN皮，取出子葉胚作為外植體。
[0012]進(jìn)一步講，所述步驟I)的培養(yǎng)條件為:溫度25±2°C，光照時(shí)間12_16h /天，光照強(qiáng)度 2000-25001ux ；
步驟2)的培養(yǎng)條件為:溫度25±2°C，光照時(shí)間12-16h /天，光照強(qiáng)度2000_25001ux ； 步驟3)的培養(yǎng)條件為:溫度25±2°C，光照時(shí)間12-16h /天，光照強(qiáng)度2000_25001ux。
[0013]進(jìn)一步講，所述步驟I)中愈傷組織的誘導(dǎo)時(shí)間為10-17天，外植體成為長(zhǎng)滿淺綠色的愈傷組織；
步驟2)中的增殖時(shí)間為30-60天，淺綠色愈傷組織逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏w粒狀愈傷組織；
步驟3)中的誘導(dǎo)分化時(shí)間為60-90天，黑色顆粒狀愈傷組織分化生成淺黃色的胚性愈傷組織；
步驟4)中的再生培養(yǎng)時(shí)間為30天，體細(xì)胞胚萌發(fā)生成再生苗。
[0014]進(jìn)一步講，對(duì)步驟4)中經(jīng)再生培養(yǎng)后得到的完整植株進(jìn)行煉苗，方法為:待再生苗長(zhǎng)出3-5片真葉時(shí)，逐步打開(kāi)組培瓶蓋，使再生植苗與空氣接觸，在20-25°C下煉苗7-10天。
[0015]進(jìn)一步講，所述楸樹(shù)的體外培養(yǎng)方法還包括移植，待再生苗生長(zhǎng)至5cm左右時(shí)，將再生苗從培養(yǎng)瓶中移至緩沖間培養(yǎng)，再將再生苗移至培養(yǎng)室外常溫培養(yǎng)，再取出再生苗，在流水下徹底清洗根部的培養(yǎng)基，最后將再生苗移至已滅菌培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)。
[0016]本發(fā)明提供了楸樹(shù)的一種體外培養(yǎng)方法。該方法是利用未成熟子葉胚及其它類似材料作為外植體，通過(guò)胚性愈傷組織誘導(dǎo)途徑得到再生植株。以子葉胚為外植體進(jìn)行離體再生的優(yōu)勢(shì)在于取材方便、可提供的材料充足。用該方法可高頻率地誘導(dǎo)出大量的楸樹(shù)體細(xì)胞胚胎，再生植株成活率高，可達(dá)85 %，而且具有再生植株變異小和遺傳穩(wěn)定性較高的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明為擴(kuò)大楸樹(shù)的繁殖系數(shù)、該物種的種質(zhì)保存及其遺傳轉(zhuǎn)化奠定了良好的基礎(chǔ)，應(yīng)用前景廣闊。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1為未成熟子葉胚誘導(dǎo)的愈傷組織。
[0018]圖2為增殖后的黑色顆粒狀愈傷組織。
[0019]圖3為胚性愈傷組織。
[0020]圖4為顯微鏡下觀察到的球形胚。
[0021]圖5為顯微鏡下觀察到的心形胚。
[0022]圖6為顯微鏡下觀察到的魚(yú)雷胚。
[0023]圖7為顯微鏡下觀察到的子葉胚。
[0024]圖8為胚狀體。
[0025]圖9為體細(xì)胞胚萌發(fā)的小植株。
[0026]圖10為煉苗成活的再生植株。
[0027]圖11為本發(fā)明方法步驟。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。
[0029]1/2MS基本培養(yǎng)基:可參照文獻(xiàn)(Murashige T, Skoog F.A revised medium forrapid grouth and b1assays with tobacco tissue cultures.Phys1l.Plant, 1962，15: 473-497)配制，僅將大量元素減為原來(lái)的一半。
[0030]如圖11中，楸樹(shù)的體外培養(yǎng)方法主要內(nèi)容如下，滅菌——愈傷組織的誘導(dǎo)——愈傷組織的增殖一一胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及體細(xì)胞胚的分化一一植株再生一一移植，并以未成熟的子葉胚為外植體具體實(shí)施如下:
I)子葉胚的滅菌
取楸樹(shù)未成熟細(xì)長(zhǎng)蒴果，用75%酒精棉球擦拭消毒2-3遍，進(jìn)入無(wú)菌操作臺(tái)用75%的酒精棉球再擦拭消毒2-3遍，戴上無(wú)菌手套剝?nèi)ス?，然后?%的NaClO對(duì)種子進(jìn)行表面消毒4min,無(wú)菌水清洗5次，4°C過(guò)夜(時(shí)間不少于10小時(shí))；再用2%的NaClO浸泡3min,無(wú)菌水清洗5次。戴上無(wú)菌手套剝?nèi)シN皮，取出子葉胚作為外植體。
[0031]2)愈傷組織的誘導(dǎo)及含有不同濃度6-芐基腺嘌呤出-BA)和2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4-D)組合的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果比較。
[0032]愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基:在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了 6-芐基腺嘌呤(6-BA) 0-2.0mg/L 和 2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) 0-2.0mg/L。
[0033]以步驟I)獲得的經(jīng)滅菌的未成熟子葉胚為外植體，將其置于上述含有不同濃度6-芐基腺嘌呤出-BA)和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)組合的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(每個(gè)培養(yǎng)瓶中接種20粒，每個(gè)組合接種5瓶，重復(fù)3次)上，在溫度25±2°C，光照時(shí)間12_16h /天，光照強(qiáng)度2000-25001UX下誘導(dǎo)愈傷組織，并對(duì)含有不同濃度6-芐基腺嘌呤出-BA)和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)組合的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果進(jìn)行比較。
[0034]結(jié)果在含不同濃度6-芐基腺嘌呤(6-BA)和2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4_D)組合的MS培養(yǎng)基上的子葉胚外