物稀釋液、梔子提取物稀釋液、連翹提取物稀釋 液和玄參提取物稀釋液。需要說明的是，上述稀釋過程均在無菌條件下進(jìn)行操作。
[0045] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，利巴韋林稀釋液、柴胡提取物稀釋液、板藍(lán)根提取物稀釋 液、地黃提取物稀釋液、黃芩提取物稀釋液、梔子提取物稀釋液、連翹提取物稀釋液和玄參 提取物稀釋液的用量并不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，基于1000毫升的雙蒸餾 水，在抗病毒劑中，利巴韋林稀釋液、柴胡提取物稀釋液、板藍(lán)根提取物稀釋液、地黃提取物 稀釋液、黃芩提取物稀釋液、梔子提取物稀釋液、連翹提取物稀釋液和玄參提取物稀釋液可 以分別獨立的為1毫升。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，藥物濃度過高，精子耐受性差，從而影響精子存活率 及存活時間。需要說明的是，上述利巴韋林稀釋液、柴胡提取物稀釋液、板藍(lán)根提取物稀釋 液、地黃提取物稀釋液、黃芩提取物稀釋液、梔子提取物稀釋液、連翹提取物稀釋液和玄參 提取物稀釋液分別以無菌操作方法用移液管移取到10毫升的離心管中，并在漩渦振蕩器 中震蕩10分鐘，然后用安瓿瓶無菌分裝封存，室溫保藏。
[0046] 需要特別說明的是，豬抗病毒精液稀釋液中除抗病毒劑以外的其它成分，均在使 用前12小時以內(nèi)以無菌操作方法按比例進(jìn)行混合。
[0047] 下面參考具體實施例，對本發(fā)明進(jìn)行描述，需要說明的是，這些實施例僅僅是描述 性的，而不以任何方式限制本發(fā)明。
[0048] 實施例
[0049] 原料配方：
[0050] 15. 50g的葡萄糖、11. 65g的朽1檬酸三鈉、2. 35g的EDTA鈉鹽、I. 75g的碳酸氫鈉、 1.0 Og的聚乙烯醇、5. 50g的三羧甲基氨基甲燒、4. IOg的朽1檬酸、0. 07g的半胱氨酸、1.0 Og 的維生素C、0.1 Og的恩諾沙星、50ml抗病毒劑。
[0051] 制備方法：
[0052] 將以上各個成分按照以上組成充分混合至1000 ml的雙蒸餾水中。
[0053] 評價：
[0054] 1、分別對實施例所得豬抗病毒精液稀釋液的抗豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（PRRSV) 效果、對精子質(zhì)量影響和對母豬繁殖力影響進(jìn)行檢測。
[0055] 2、評價指標(biāo)和測試方法：
[0056] A、抗豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（PRRSV)效果的檢測：
[0057] 1)試驗材料
[0058] Marcl45細(xì)胞、PK15細(xì)胞、小牛血清（上海正極生物科技有限公司）、DMEM培養(yǎng)液 (上海博谷生物科技有限公司）、〇. 25%胰蛋白酶（美國GIBC0G0公司）、中藥提取物濃縮 液、MTT (噻唑藍(lán)）、二甲基亞砜、青鏈霉素液、PBS (磷酸鹽緩沖液）。
[0059] 2)試驗儀器
[0060] 超凈工作臺SCW_HS(蘇州宏瑞凈化科技有限公司）、恒溫水浴箱、倒置顯微鏡 (LWD300-38LT，上海測維光電技術(shù)有限公司）、二氧化碳培養(yǎng)箱（北京鴻達(dá)天矩試驗設(shè)備有 限公司）、離心機(jī)（杭州藏漢科技有限公司）、培養(yǎng)瓶、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、酶標(biāo)儀（Thermo公 司）。
[0061] 3)病毒滴度測定
[0062] PRRSV滴度測定：按常規(guī)方法培養(yǎng)Marcl45細(xì)胞，經(jīng)0. 25%胰蛋白酶消化成單細(xì) 胞，細(xì)胞數(shù)調(diào)整至2X IO5個/ml，在每孔中加入Marcl45細(xì)胞懸液100 μ L，5%二氧化碳培 養(yǎng)箱培養(yǎng)。PRRSV用DMEM培養(yǎng)液在I. 5mL Ep管中作連續(xù)10倍稀釋。將10 ^lO 1(]稀釋病 毒液接種單層細(xì)胞培養(yǎng)板，每稀釋度8孔，每孔接種100 μ L。設(shè)2排作對照（100 μ 1生長液 +100μ 1細(xì)胞懸液），置37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)10天。
[0063] 4)抗病毒藥物樣品對Marcl45細(xì)胞毒性測定
[0064] 按常規(guī)方法消化傳代Marcl45細(xì)胞，用細(xì)胞生長液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度，在96孔細(xì)胞 培養(yǎng)板上，每孔加 IOOy L Marcl45細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板置于5 %二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待 Marcl45細(xì)胞長成單層貼壁細(xì)胞。8組中藥提取物用細(xì)胞維持液作連續(xù)稀釋后，將10 LlO 7 稀釋液添加到培養(yǎng)好單層細(xì)胞的培養(yǎng)板中，每孔加入IOOul藥物稀釋液，每個稀釋梯度重 復(fù)5孔，設(shè)細(xì)胞對照孔（不含藥物），置5 %二氧化碳培養(yǎng)箱，每天觀察CPE情況，以確定藥 物對細(xì)胞最大無毒濃度。培養(yǎng)96h后，吸去上清，用PBS沖2-3遍后，加入20 μ LMTT溶液 (5mg/ml，即0. 5% ΜΤΤ)，培養(yǎng)4小時，去處孔內(nèi)培養(yǎng)液，吸取時盡量避免碰到細(xì)胞。每孔加 二甲基亞砜（DMSO) 150ul，置搖床上低速振蕩15min，使DMSO溶解藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚。設(shè)對照 孔（細(xì)胞維持液、細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），用 酶聯(lián)免疫檢測儀在〇D570nm處測吸光值。
[0065] 5)抗病毒藥物樣品對PRRSV的殺滅作用試驗
[0066] 將IOOTCId5。病毒（PRRSV，2%新生牛血清的維持液）與等體積不同稀釋度的藥物 樣品混合，37°C作用2h。按常規(guī)方法消化傳代Marcl45細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，每孔接種IOOul 細(xì)胞懸液，培養(yǎng)至細(xì)胞長滿單層后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗三次，接入作用2h后病毒與中藥提 取物的混合液，IOOul/孔，重復(fù)4孔，另設(shè)細(xì)胞對照和病毒對照。37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)至 病毒對照出現(xiàn)CPE。吸去上清，用PBS沖2-3遍后，加入20 μ LMTT溶液（5mg/ml，即0· 5% MTT)，培養(yǎng)4小時后，移去培養(yǎng)液，每孔加二甲基亞砜150ul，置搖床低速振蕩15min，使甲瓚 結(jié)晶物溶解。同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜）。在酶聯(lián)免疫檢測儀0D570nm處 測量各孔的吸光值。
[0067] 6)抗病毒藥物樣品對PRRSV的抑制作用試驗
[0068] 按常規(guī)方法消化傳代Marcl45細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，每孔接種IOOul細(xì)胞懸液，培 養(yǎng)至細(xì)胞長滿單層后加入不同稀釋度的藥物樣品，IOOul/孔，重復(fù)4孔。37°C培養(yǎng)2h，棄去 藥液加入IOOTCId5。病毒液，IOOul/孔，另設(shè)細(xì)胞對照和病毒對照。37°C、5%二氧化碳培養(yǎng) 至病毒對照出現(xiàn)CPE。吸去上清，用PBS沖2-3遍后，加入20 μ LMTT溶液（5mg/ml，即0· 5% MTT)，培養(yǎng)4小時后，移去培養(yǎng)液，每孔加二甲基亞砜150ul，置搖床低速振蕩15min，使甲瓚 結(jié)晶物溶解。同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜）。在酶聯(lián)免疫檢測儀0D570nm處 測量各孔的吸光值。
[0069] 7)抗病毒藥物樣品對PRRSV的阻斷作用試驗
[0070] 按常規(guī)方法消化傳代Marcl45細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，每孔接種IOOul細(xì)胞懸液，培 養(yǎng)至細(xì)胞長滿單層后，加入IOOTCId 5。病毒液（PRRSV，2%新生牛血清的維持液），IOOul/孔， 重復(fù)4孔。置37°C培養(yǎng)2h后，棄去病毒液加入不同稀釋度的藥物樣品，IOOul/孔，另設(shè)細(xì) 胞對照和病毒對照。37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)至病毒對照出現(xiàn)CPE。吸去上清，用PBS沖2-3 遍后，加入20 μ LMTT溶液（5mg/ml，即0. 5 % MTT)，培養(yǎng)4小時后，移去培養(yǎng)液，每孔加二甲 基亞砜150ul，置搖床低速振蕩15min，使甲瓚結(jié)晶物溶解。同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、 二甲基亞砜）。在酶聯(lián)免疫檢測儀0D570nm處測量各孔的吸光值。
[0071] B、對精子質(zhì)量影響的檢測：
[0072] 將采集到的公豬原精液快速帶到精液稀釋液車間，稱量原精液體積質(zhì)量后確定稀 釋比例。先用等溫抗病毒精液稀釋液緩慢注入等容積的原精液中，靜置平衡15分鐘，用雙 目相差顯微鏡檢查精子活率，根據(jù)活率和原精液容積確定稀釋比。根據(jù)稀釋比將原精液進(jìn) 一步稀釋到比例容積，靜置進(jìn)行室溫平衡后毛巾包裹放入精子專用恒溫冰箱保存。
[0073] 將在顯微鏡37°C溫度下能夠進(jìn)行直線前進(jìn)運動的精子稱為有效精子，精子的活力 是指有效精子占總精子數(shù)的百分率。精子直線前進(jìn)的能力是精子代謝正常及質(zhì)膜完整性的 主要表現(xiàn)，只有有效精子才有與母豬卵子結(jié)合而受精的能力。精子活率是精液質(zhì)量評價最 重要的指標(biāo)。一般情況下.正常進(jìn)行人工授精的精液精子活力不應(yīng)低于〇. 7,即顯微鏡檢查 有不低于70 %的精子做直線運動。
[0074] C、抗病毒精液稀釋液對豬繁殖力影響檢測：
[0075] 應(yīng)用本發(fā)明獲得的抗病毒精液稀釋液配方，分別在海南羅牛山畜牧總公司和海南 農(nóng)墾畜牧集團(tuán)有限公司的養(yǎng)豬場，對杜洛克、長白、大白三個品種進(jìn)行了高效精液稀釋液人 工授精實際應(yīng)用效果評價試驗、同時與公母豬自然配種方式進(jìn)行比較試驗，觀察其對受胎 率、產(chǎn)仔數(shù)等繁殖性能的影響，比較抗病毒精液稀釋液在3個品種間受胎率、產(chǎn)仔數(shù)等繁殖 性能的差異。
[0076] 3、檢測結(jié)果：
[0077] A、豬抗病毒