一種石蒜屬植物外植體的消毒方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物快速繁殖技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種石蒜屬植物外植體的消毒方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 石蒜屬植物無(wú)菌播種體系的建立對(duì)其規(guī)?；a(chǎn)繁育、雜交育種和良種選育及石 蒜堿的提取具有重要意義。
[0003] 石蒜屬植物的繁育研究多集中在無(wú)性繁殖，而種子繁殖是在不影響母鱗莖生長(zhǎng)的 前提下獲得觀賞植物花色及花型等自然變異的重要途徑。無(wú)菌播種較基質(zhì)播種可以顯著提 高種子萌發(fā)率、促進(jìn)原生鱗莖發(fā)育及增殖，在短期內(nèi)獲得大量無(wú)菌苗，這也是解決石蒜屬植 物快速繁育問(wèn)題的關(guān)鍵。
[0004] 目前，關(guān)于石蒜屬植物無(wú)菌播種的報(bào)道十分有限。
[0005] 姚麗娟（姚麗娟，楊燕萍，徐曉薇等.換錦花繁殖技術(shù)研究[J].北方園 藝.2010(12) :83-85.)初步篩選出換棉花無(wú)菌播種的較適培養(yǎng)基MS+6-BAlmg/L+NAA 0. 2mg/L，但試驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)污染的比例高達(dá)2/3。
[0006] 而佘琳芳（佘琳芳.石蒜屬植物小鱗莖的繁殖技術(shù)及其化學(xué)調(diào)控研究[D].浙江 大學(xué)，2014.)通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明無(wú)菌播種可以明顯提高種子繁殖系數(shù)（一粒種子最多獲得了 7 個(gè)小鱗莖），但由于污染率過(guò)高，未能篩選出最佳培養(yǎng)基配方。
[0007] 可見(jiàn)，石蒜屬植物尚未建立較為成熟的無(wú)菌播種繁育體系，這也在很大程度上限 制了其規(guī)?；a(chǎn)繁育、園林應(yīng)用與推廣。
[0008] 現(xiàn)在應(yīng)用于石蒜屬植物無(wú)菌播種繁育體系中的消毒方法主要有：果皮燃燒法（佘 琳芳.石蒜屬植物小鱗莖的繁殖技術(shù)及其化學(xué)調(diào)控研究[D].浙江大學(xué)，2014.)、次氯酸鈉 浸泡法。但是都由于試驗(yàn)中污染率過(guò)高而未能篩選出較優(yōu)的無(wú)菌播種滅菌方法。
[0009] 因此，如何有效地降低污染率成為了石蒜屬植物無(wú)菌播種技術(shù)的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明提供了一種石蒜屬植物外植體的消毒方法，該方法可顯著降低石蒜屬植物 無(wú)菌播種過(guò)程中種子的污染率，減少細(xì)菌、真菌對(duì)種子的污染，且提高種子的萌發(fā)率。
[0011] -種石蒜屬植物外植體的消毒方法，包括：
[0012] 從石蒜屬植物果實(shí)中取出種子，將所述種子表面消毒后置于溫水中浸泡，吸脹后 取出，再置于升汞中進(jìn)行渦旋振蕩離心處理，處理完成后漂洗干凈，獲得無(wú)菌外植體。
[0013] 所述表面消毒的方法包括：將種子置于體積濃度為75%的乙醇中浸泡30~40 秒。種子在浸泡前先進(jìn)行表面消毒可以避免浸泡過(guò)程中表面細(xì)菌的滲入，降低種子的污染 率。
[0014] 將種子置于溫水中浸泡的目的在于使種子充分吸水吸脹以降低滲入種子內(nèi)部的 滅菌試劑的濃度，減小其對(duì)種子的傷害，從而保持種子活力。作為優(yōu)選，所述浸泡的溫度為 35~38°C，時(shí)間為5~6小時(shí)。
[0015] 升汞作為常規(guī)的消毒試劑被廣泛應(yīng)用于種子的消毒中，一般采用的質(zhì)量濃度為 〇. 1%。常規(guī)的消毒方法通常是將種子直接浸泡于升汞中進(jìn)行消毒，并在短時(shí)間內(nèi)取出種 子，用清水多次沖洗種子，以避免升汞滲入種子中的濃度過(guò)高，傷害種子，降低種子活力。上 述方法由于時(shí)間較短造成升汞只能對(duì)種子進(jìn)行表面的殺菌，種子內(nèi)部的消毒效果較差；想 要提高消毒效果只能延長(zhǎng)浸泡時(shí)間，但這又會(huì)造成種子活力的降低，影響后續(xù)的播種繁殖 過(guò)程。
[0016] 通常，內(nèi)生菌較少的種子采用上述直接在升汞中短時(shí)浸泡的方式就可以實(shí)現(xiàn)種子 的消毒，種子污染率較低；但是，石蒜屬植物種子是一種易受內(nèi)生菌侵染的種子，采用上述 直接在升汞中短時(shí)浸泡的方法進(jìn)行消毒，種子的污染率仍然較高，所以上述常規(guī)方法不適 用于石蒜屬植物種子。
[0017] 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，先將種子進(jìn)行溫水浸泡后，再將浸泡于升汞溶液中的石蒜屬植物種子 連同升汞溶液一同進(jìn)行渦旋振蕩，種子的污染率顯著降低；分析其原因可能是渦旋振蕩過(guò) 程可以使升汞溶液短時(shí)間內(nèi)快速滲入種子中起到殺菌消毒作用；由于渦旋振蕩時(shí)間較短， 加上振蕩前已經(jīng)對(duì)種子進(jìn)行溫水浸泡處理，所以升汞不易對(duì)種子造成損傷，不會(huì)影響種子 的活力。
[0018] 作為優(yōu)選，所述渦旋振蕩離心的頻率為2000~2500轉(zhuǎn)/分鐘；時(shí)間為8~10分 鐘。
[0019] 作為優(yōu)選，浸泡完成后，先將吸脹的種子置于體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇中進(jìn)行表面 消毒，再將消毒后的種子置于升汞中進(jìn)行渦旋振蕩離心處理。所述表面消毒的時(shí)間為30~ 40秒。種子浸泡過(guò)程和升汞渦旋振蕩過(guò)程中間也應(yīng)該進(jìn)行消毒，可以進(jìn)一步避免種子受到 污染。
[0020] 同樣，從石蒜屬植物果實(shí)中取出種子的過(guò)程也應(yīng)該進(jìn)行消毒，所以，所述石蒜屬植 物果實(shí)的消毒過(guò)程包括：用表面活性劑浸泡石蒜屬植物果實(shí)，后用流水沖洗至無(wú)明顯泡沫， 再用乙醇進(jìn)行表面滅菌。
[0021] 所述表面活性劑為吐溫或洗潔精。作為優(yōu)選，表面活性劑浸泡的時(shí)間為15~ 20min〇
[0022] 所述表面滅菌的過(guò)程包括：將石蒜屬植物果實(shí)置于體積濃度為95%的乙醇中浸 泡3~5秒后，點(diǎn)燃石蒜屬植物果實(shí)，燃燒至果實(shí)外表皮自然熄滅。
[0023] 進(jìn)一步地，所述的石蒜屬植物外植體包括：換棉花自交種子、忽地笑自交種子、長(zhǎng) 筒石蒜與換錦花雜交后的種子、換錦花與紅藍(lán)石蒜雜交后的種子。
[0024] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0025] 本發(fā)明將石蒜屬植物種子進(jìn)行溫水浸泡后，使種子充分吸水吸脹，再置于升汞中 進(jìn)行短時(shí)渦旋振蕩，使升汞充分滲入種子中，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)充分殺菌，降低石蒜屬植物種子 的污染率，使污染率控制在5. 0%左右，而且能夠保持種子的活力，獲得較高的種子萌發(fā)率。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為實(shí)施例5中所述的五種方法消毒后的效果對(duì)比圖。
[0027] 圖2為實(shí)施例1中換錦花自交種子無(wú)菌播種萌發(fā)20天的狀態(tài)圖。
[0028] 圖3為實(shí)施例2中忽地笑自交種子無(wú)菌播種萌發(fā)15天的狀態(tài)圖。
[0029] 圖4為實(shí)施例3中長(zhǎng)筒石蒜與換錦花雜交種子無(wú)菌播種萌發(fā)5天的狀態(tài)圖。
[0030] 圖5為實(shí)施例3中長(zhǎng)筒石蒜與換錦花雜交種子無(wú)菌播種萌發(fā)30天的狀態(tài)圖。
[0031] 圖6為實(shí)施例4中換錦花與紅藍(lán)石蒜雜交種子無(wú)菌播種萌發(fā)30天的狀態(tài)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但本發(fā)明不僅僅局限于下列實(shí)施 例。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] (1)于9~10月采收成熟的換錦花自交果實(shí)，置于含少許Tween-20的水中浸泡 15分鐘，用流水沖洗2小時(shí)；于超凈工作臺(tái)上，用鑷子夾住果柄將果實(shí)浸沒(méi)于（v/v) 95 %乙 醇3~5秒后，于酒精燈上點(diǎn)燃，燃燒至果皮自然熄滅，再用鑷子和解剖刀剝出完整種子，將 種子用（v/v) 75%酒精表面滅菌30秒，再用去離子水漂洗3遍。
[0035] (2)選取色澤黑亮、成熟飽滿的種子放于盛裝清水的干凈柱形瓶中，水面沒(méi)過(guò)種子 即可，再將柱形瓶置于37°C水浴鍋中水浴6小時(shí)。
[0036] (3)浸泡完成后將種子夾出放入50mL滅菌離心管，每管放入種子總體積小于等 于離心管體積的1/3 ;向離心管中加入75%乙醇浸泡搖晃消毒30秒，倒出酒精后，再加入 (w/v) 0.1 %升汞溶液至恰好浸沒(méi)種子。手按住離心管于渦旋振蕩器（VOTERSHAKER，型號(hào) WH-861)上離心8分鐘，最后用無(wú)菌水漂洗5遍，每遍不少于3分鐘。
[0037] (4)于超凈工作臺(tái)上，用無(wú)菌鑷子夾住種子，種孔朝下，使種子約1/2部分輕插入 培養(yǎng)基內(nèi)，每培養(yǎng)皿接種6粒，每柱形瓶接種4粒。
[0038] (5)用于接種的培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基（MurashigeandSkoog，1962)為基本培養(yǎng)基， 即每升培養(yǎng)基添加4. 43gMS粉，所述培養(yǎng)基中還含有30g/L的蔗糖和8g/L瓊脂，pH值為 5. 8〇
[0039] (6)接種完成后，將外植體置于無(wú)菌培養(yǎng)室進(jìn)行光照培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度 約 12. 5ymol?m2 ?s\光照時(shí)間 14h?d\溫度（25±2)°C。
[0040] 結(jié)果：至培養(yǎng)第8天時(shí)，僅出現(xiàn)少量真菌污染，污染率為5. 0%。經(jīng)過(guò)4°C沙藏30 天的換錦花自交種子于培養(yǎng)第3天開(kāi)始萌發(fā)，30天內(nèi)發(fā)芽率達(dá)到79. 00%。
[0041] 圖2為換錦花自交種子無(wú)菌播種萌發(fā)20天后小鱗莖狀態(tài)，子葉基部逐漸膨大、胚 根逐漸伸長(zhǎng)。
[0042] 實(shí)施例2
[0043] (1)于10~11月采收成熟的忽地笑自交果實(shí)，置于含少許Tween-20的水中浸泡 20分鐘，用流水沖洗3小時(shí)；于超凈工作臺(tái)上，用鑷子夾住果柄將果實(shí)浸沒(méi)于（v/v) 95 %乙 醇3~5秒后，于酒精燈上點(diǎn)燃，燃燒至果皮自然熄滅，再用鑷子和解剖刀剝出完整種子，將 種子用（v/v) 75%酒精表面滅菌30秒，再用去離子水漂洗3遍。
[0044] (2)選取色澤黑亮、成熟飽滿的種子放于盛裝清水的干凈柱形瓶中，水面沒(méi)過(guò)種子 即可，再將柱形瓶置于37°C水浴鍋中水浴6小時(shí)。
[0045] (3)浸泡完成后將種子夾出放入50mL滅菌離心管，每管放入種子總體積小于等 于離心管體積的1/3 ;向離心管中加入75%乙醇浸泡搖晃消毒30秒，倒出酒精后，再加入 (w/v) 0.1 %升汞溶液至恰