一種可用于低海拔地區(qū)之全人工培育冬蟲夏草的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于藥食用菌培育技術領域，涉及一種冬蟲夏草的培育方法。
【背景技術】
[0002]冬蟲夏草[Oph1cordycepssinensis (Berk.)G.H.Sung et al.]別名蟲草、冬蟲草、夏草冬蟲。是由冬蟲夏草菌 Oph1cordyceps sinensis (Berk.) G.H.Sung et al.寄生在蝙蝠蛾科Hepialidae蝠蛾屬Hepialus昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復合體。野生冬蟲夏草分布在我國西藏、青海、云南、四川及甘肅等省區(qū)3000?5000m的高寒草甸區(qū)，且對生境要求極其特殊。在自然條件下，其生活史極其復雜，必須經(jīng)過相對獨立的分生孢子階段和子囊孢子階段的轉(zhuǎn)變，其寄主蝙蝠蛾需要5?6年才能完成一個世代，其中85%以上的時間營地下生活，全年具有世代重疊現(xiàn)象。中醫(yī)認為:冬蟲夏草性溫而味甘，藥用價值極高，具有補肺、益腎、補精髓及諸虛百損、止咳化痰、抗白血病、抗抑郁癥、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)之功效。
[0003]面對環(huán)境的破壞、蟲草產(chǎn)量減少，人類對蟲草需求的增加等問題，人工培育冬蟲夏草成了一種趨勢，更是大家在科學界探索的目標。由于蟲草培育過程中對環(huán)境要求很高，通常在高海拔地區(qū)進行培育，如何能在日常環(huán)境中，特別是低海拔地區(qū)培育出在成分、外觀等與野生蟲草一致的冬蟲夏草，目前并沒有相關技術報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種冬蟲夏草的培育方法，以克服現(xiàn)有技術的不足。
[0005]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明冬蟲夏草的培育方法，包括以下步驟:
[0006](I)菌種準備:
[0007]挑選完整新鮮野生蟲草，用無菌水沖洗過夜后，在潔凈工作臺剝開蟲體部分，勾取里面菌絲培養(yǎng)，依生長情況，培養(yǎng)90-120天后，低溫、光照的條件在培養(yǎng)基斜面上長出子實體，選擇符合要求的子實體進行純化擴培，經(jīng)分子鑒定確定為菌種無誤后進行生產(chǎn)發(fā)酵擴大；
[0008](2)寄主工程:
[0009]I)在野外采集的第一代蟲蝙蝠蛾蛹用濾紙保濕培養(yǎng)，羽化為成蟲后，經(jīng)形態(tài)鑒定其物種，成蟲安排在羽化帳中，羽化帳底部鋪臘紙，在蠟紙上放入樹枝，以便成蟲攀附產(chǎn)卵；產(chǎn)卵后將卵收集，將其放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其中采用常規(guī)濾紙保濕方法保持卵的濕度，培養(yǎng)溫度為12-15°C，培養(yǎng)時間為28-40天；培養(yǎng)結束后用無菌水沖洗干凈；
[0010]2)待卵孵化后模擬高山草甸環(huán)境飼養(yǎng)幼蟲，養(yǎng)蟲的基質(zhì)層以草炭土、泥炭土、沙土、蛭石為主，含水量約35-40% ;基質(zhì)層用于模擬高山環(huán)境用腐殖土。用于養(yǎng)蟲的外部環(huán)境為低溫高濕環(huán)境，溫度約為14°C，空間濕度約為50%，卵期和蛹期及成蟲飼養(yǎng)空間濕度為90% ;每個養(yǎng)蟲盒飼養(yǎng)100條蟲；
[0011](3)世代循環(huán):
[0012]按上述方式飼養(yǎng)后的第二年的3-6月翻開基質(zhì)，可發(fā)現(xiàn)第二代蛹，按雌雄分開飼養(yǎng)，飼養(yǎng)基質(zhì)層與在前的基質(zhì)層相同，方便以后進行雌雄配比羽化交尾，養(yǎng)蛹濕度比養(yǎng)蟲的濕度大，為60%，空間濕度每天用造霧器噴2次水霧，保持土壤和空間濕度，進行二代蟲的飼養(yǎng)，依此方法可進行世代循環(huán)；
[0013](4)侵染工程:
[0014]采用下述方法中的任意一種:
[0015]方法一:用第一步分離確定之菌種進行常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)，用得到菌絲用300目濾網(wǎng)過濾，將濾網(wǎng)上的菌絲倒在5%的葡萄糖溶液中，用打碎機搗碎，再用100目過濾網(wǎng)過濾，保留濾液作為侵染液，此時的侵染液中含有液體發(fā)酵的孢子和菌絲段，拌入養(yǎng)蟲基質(zhì)層第三層沙土層中，利用幼蟲食入腸道或者接觸表皮氣孔達到侵染的目的；
[0016]方法二:利用人工培養(yǎng)冬蟲夏草用針刺侵染裝置進行針刺侵染，所述進行針刺侵染針筒的外側壁上設有針頭容納盒，針筒的頭部設有針頭，針頭上包裹硅膠墊，針頭露出硅膠墊(5)的長度為1.3-1.6_，針頭的直徑為0.15-0.3mm ;用發(fā)酵液顏色為棕黃色或者黃黑色的發(fā)酵菌絲經(jīng)過300目濾網(wǎng)或者miracloth過濾、將濾網(wǎng)上的菌絲倒在5%的葡萄糖溶液中，用打碎機搗碎，再用兩層紗布過濾，收集濾液用低溫離心機在4°C下離心30分鐘，離心機轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分鐘。離心后發(fā)現(xiàn)離心管底部為菌絲餅狀或團狀，最上面一層為幾乎是純水，用針頭抽取菌絲餅或團之上、純水層之下的中間層液體，作為針刺侵染液；采用手動的方法，針刺蝙蝠蛾幼蟲，針刺時的深度把握，以硅膠墊的頭部輕觸為準；
[0017](5)人工培養(yǎng)出草:
[0018]侵染后幼蟲在第二年2月以后會陸續(xù)出現(xiàn)僵死蟲，翻開基質(zhì)收集僵蟲，表面用75 %酒精快速消毒，編號后栽在與除開飼料層養(yǎng)蟲環(huán)境相同的基質(zhì)中，濕度約為50 %，放在培養(yǎng)箱中，模擬高山環(huán)境，晝夜變溫，其中采用日光燈照射8-9小時，溫度控制在15°C -17°C之間，晚上溫度控制在3°C -4°C之間，無日光燈照射，時間為15-16小時，待有微微出草時，每天中午采用波長275-420nm的紫外線照射處理10分鐘，培養(yǎng)直至出草到適當高度后取出，即得人工培養(yǎng)的冬蟲夏草。
[0019]進一步地，其特征在于，所述菌種為中國科學院微生物研究所鑒定編號為(2015)微檢字第032號的菌種，所述菌種編號為KD2B2Ol的中國被毛孢菌株，且能經(jīng)過經(jīng)低溫、光照條件在培養(yǎng)基斜面上長出子實體的菌株。
[0020]進一步地，所述基質(zhì)層的第一層為以草炭土和泥炭土腐殖質(zhì)較高的腐殖質(zhì)層，第二層為飼料層，第三層以沙土為主，最下層以蛭石為主；將濕度調(diào)節(jié)好的各層基質(zhì)分別放置3個月，此時基質(zhì)微生物環(huán)境穩(wěn)定，再配制基質(zhì)層用于幼蟲飼養(yǎng)，所述基質(zhì)層鋪設厚度為2_10cmo
[0021]進一步地，步驟(5)中日光燈光照強度為80001x。
[0022]進一步地，幼蟲的飼料為珠芽寥、圓穗寥、胡蘿卜和甘露子等混合飼料。
[0023]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明的制備方法適用于在低海拔地區(qū)全人工培養(yǎng)冬蟲夏草，涉及寄主(即蝙蝠蛾幼蟲)工程、菌種工程、侵染工程和出草工程等多個技術特點，將各個技術有效的結合，各步驟準確無誤的實施，最終成功培育出在成分、外觀等與野生蟲草一致的冬蟲夏草。其中菌種準備步驟中新增了實體催生確認步驟，保證分離出合格的菌種，提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)量。此外還采用了特定的養(yǎng)蟲方式，保證了蟲體培育的世代循環(huán)。特別是采用該技術人工培育的冬蟲夏草與野生冬蟲夏草相比，蛋白質(zhì)組分相似度比例超過95%，具有廣闊的市場應用前景。
【具體實施方式】
[0024]下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。
[0025]實施例1
[0026](I)菌種準備:
[0027]挑選完整新鮮野生蟲草，用無菌水沖洗過夜后，在潔凈工作臺剝開蟲體部分，勾取里面菌絲培養(yǎng)，依生長情況，培養(yǎng)90—120天后在培養(yǎng)基斜面上長出子實體，選擇符合要求的子實體進行純化擴培，經(jīng)分子鑒定確定為菌種無誤后進行生產(chǎn)發(fā)酵擴大。所述菌種為所述菌種編號為KD2B201的中國被毛孢菌株。
[0028](2)寄主工程:
[0029]I)在野外采集的第一代蟲蝙蝠蛾蛹用濾紙保濕培養(yǎng)，羽化為成蟲后，經(jīng)形態(tài)鑒定其物種，成蟲安排在羽化帳中，羽化帳底部鋪臘紙，在蠟紙上放入樹枝，以便成蟲攀附產(chǎn)卵。產(chǎn)卵后將卵收集，將其放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其中采用常規(guī)濾紙保濕方法保持卵的濕度，培養(yǎng)溫度為13°C，培養(yǎng)時間為35天。培養(yǎng)結束后用無菌水沖洗干凈。
[0030]2)待卵孵化后模擬高山草甸環(huán)境飼養(yǎng)幼蟲，幼蟲的飼料為珠芽寥、圓穗寥、胡蘿卜和甘露子等混合飼料?；|(zhì)層的第一層為以草炭土和泥炭土腐殖質(zhì)較高的腐殖質(zhì)層，第二層為飼料層，第三層以沙土為主，最下層以蛭石為主，基質(zhì)層的含水量約40% ;將濕度調(diào)節(jié)好的各層基質(zhì)分別放置3個月，此時基質(zhì)微生物環(huán)境穩(wěn)定，再配制基質(zhì)層用于幼蟲飼養(yǎng)，所述基質(zhì)層鋪設厚度為10cm。用于養(yǎng)蟲的外部環(huán)境為低溫高濕環(huán)境，溫度約為14°C，空間濕度約為50%，卵期和蛹期及成蟲飼養(yǎng)空間濕度為90%。每個養(yǎng)蟲盒飼養(yǎng)100條蟲。
[0031](3)世代循環(huán):
[0032]按上述方式飼養(yǎng)后的第二年的3-6月翻開基質(zhì)，可發(fā)現(xiàn)第二代蛹，按雌雄分開飼養(yǎng)，飼養(yǎng)基質(zhì)層與在前的基質(zhì)層相同，方便以后進行雌雄配比羽化交尾，養(yǎng)蛹濕度比養(yǎng)蟲的濕度大，為60%，空間濕度每天用造霧器噴2次水霧，保持土壤和空間濕度，進行二代蟲的飼養(yǎng)，依此方法可進行世代循環(huán)。
[0033](4)侵染工程:
[0034]用第一步分離確定之菌種進行常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)，用得到菌絲用300目或者miracloth濾網(wǎng)過濾，將濾網(wǎng)上的菌絲倒在5%的葡萄糖溶液中，用打碎機搗碎，再用兩層紗布過濾，保留濾液作為侵染液，此時的侵染液中含有液體發(fā)酵的孢子和菌絲段，