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檢測(cè)胃毒性殺蟲化合物對(duì)白符跳潛在毒性影響的試驗(yàn)方法

文檔序號(hào):9356405閱讀:689來源:國(guó)知局
檢測(cè)胃毒性殺蟲化合物對(duì)白符跳潛在毒性影響的試驗(yàn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及檢測(cè)胃毒性殺蟲化合物(包括轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白如Bt蛋白)對(duì)土壤跳蟲白符跳潛在毒性影響的試驗(yàn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]跳蟲,又稱彈尾蟲,是分布極廣的一類小型土壤節(jié)肢動(dòng)物,是土壤生態(tài)系統(tǒng)中重要的分解者,是自然界物質(zhì)循環(huán)的原動(dòng)力之一,對(duì)調(diào)節(jié)土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)發(fā)揮著十分重要的作用。由于跳蟲對(duì)土壤質(zhì)量及土壤中有毒化學(xué)物質(zhì)十分敏感,因此,跳蟲的多樣性以及群落結(jié)構(gòu)、物種組成對(duì)土壤質(zhì)量和污染狀況能起到很好的指示作用。
[0003]白符跳(Folsomia Candida)是跳蟲中最常見的一種,是對(duì)化學(xué)物質(zhì)最敏感的一種跳蟲,孤雌生殖且易于人工飼養(yǎng),因此,其作為模式生物被廣泛用于土壤中農(nóng)藥殘留和土壤質(zhì)量檢測(cè)。另外,轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的種植可通過根部分泌、植物殘?bào)w和花粉飄落向土壤中釋放轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白如Bt蛋白。因此,轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的種植對(duì)土壤非靶標(biāo)節(jié)肢動(dòng)物可能帶來的負(fù)面影響引起了相關(guān)科學(xué)家的廣泛關(guān)注,評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲植物對(duì)土壤節(jié)肢動(dòng)物潛在影響已成為了轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全評(píng)價(jià)的一個(gè)重要內(nèi)容。由于白符跳可通過取食植物殘株直接地暴露于轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的外源殺蟲蛋白。因此,以該土壤節(jié)肢動(dòng)物種作為指示性生物評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲植物產(chǎn)生的外源殺蟲蛋白對(duì)土壤非靶標(biāo)節(jié)肢動(dòng)物的潛在影響是比較合適的,已經(jīng)被研究者廣泛認(rèn)可(Michelle et al., 2005 ;Yuan et al., 2011, 2013 ;Bai etal.,2011 ;Sims et al.,1997 ;Bakonyi et al.,2011 ;Michelle et al.,2004 ;Romeis etal.,2003)。盡管如此,以往的工作主要集中在通過田間調(diào)查研究轉(zhuǎn)基因抗蟲植物種植后對(duì)跳蟲群落動(dòng)態(tài)影響方面,目前還沒有比較完善的可用于評(píng)價(jià)殺蟲劑或轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白對(duì)白符跳直接毒性影響的試驗(yàn)體系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)胃毒性殺蟲化合物對(duì)白符跳潛在毒性影響的試驗(yàn)方法,是一種可用于檢測(cè)胃毒性殺蟲劑及轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白如Bt蛋白對(duì)土壤跳蟲白符跳潛在毒性影響的試驗(yàn)技術(shù),此技術(shù)可以為農(nóng)藥及轉(zhuǎn)基因抗蟲植物環(huán)境安全研究提供技術(shù)支撐。
[0005]本發(fā)明提供的檢測(cè)胃毒性殺蟲化合物對(duì)白符跳潛在毒性影響的試驗(yàn)方法(所述殺蟲化合物為殺蟲劑或轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白),通過把殺蟲劑或轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白均勻地混入人工飼料中直接飼喂給白符跳,并設(shè)置對(duì)照處理,通過比較處理組和對(duì)照組白符跳生命參數(shù)評(píng)估受試殺蟲化合物對(duì)白符跳的潛在毒性,其特征在于,所述人工飼料為酵母粉,選用9-14天白符跳蟲開始檢測(cè)試驗(yàn)。
[0006]所述檢測(cè)試驗(yàn)持續(xù)15-30天為佳。
[0007]所述檢測(cè)試驗(yàn)優(yōu)選持續(xù)20-28天。
[0008]優(yōu)選10-12天白符跳蟲開始檢測(cè)試驗(yàn)。
[0009]優(yōu)選地,以混入陽性對(duì)照化合物的飼料作為陽性對(duì)照,所述陽性對(duì)照化合物為砷酸鉀或E-64或雪花凝集素,以沒有混入任何殺蟲化合物的飼料作為陰性對(duì)照處理。
[0010]更優(yōu)選地,以混入蛋白酶抑制劑E-64的飼料為陽性對(duì)照處理,濃度為70-250 μ gE-64/g 酵母。
[0011]所選用的白符跳優(yōu)選用如下方法飼養(yǎng)而得:將新產(chǎn)的卵塊轉(zhuǎn)移到具有基底的培養(yǎng)皿內(nèi),把培養(yǎng)皿置于人工氣候箱內(nèi)飼養(yǎng),所述人工氣候箱的條件為:溫度:20土1°C,相對(duì)濕度:70±5%,無光照,在蟲快孵化前在培養(yǎng)皿底部中央加入酵母粉,每周更換酵母粉,同時(shí)加水保持基底濕潤(rùn)。
[0012]所述檢測(cè)試驗(yàn)優(yōu)選按如下方法進(jìn)行:把受試的殺蟲化合物溶入蒸餾水中,把酵母粉混入溶液,酵母粉:溶液按1:5重量比,充分?jǐn)嚢韬?,真空冷凍干燥,分裝后置于-20°c冰箱待用;采用同樣的方法,將酵母粉以1:5重量比混入蒸餾水,冷凍干燥后置于-20°C冰箱保存,作為陰性對(duì)照飼料,將隨機(jī)選取的白符跳蟲置于具有基底的培養(yǎng)皿中,將制備好的對(duì)照或殺蟲化合物處理飼料置于培養(yǎng)皿底部中央飼喂跳蟲,飼料每隔2天更換一次,每個(gè)處理設(shè)多個(gè)重復(fù),生物測(cè)定試驗(yàn)在培養(yǎng)箱中進(jìn)行,培養(yǎng)條件為:溫度:20土1°C,相對(duì)濕度:70±5%,光照:12:12Ho
[0013]更優(yōu)選地,所述基底的形成方法為:把石膏:活性炭:水按9:1:10重量比混勻,倒入培養(yǎng)皿,室溫下凝固形成3-5mm基底,培養(yǎng)皿直徑與酵母粉加入量的比值為40-50mm:Img0
[0014]本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單、易行,可快速檢測(cè)胃毒性殺蟲劑或轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白如Bt蛋白對(duì)跳蟲的潛在毒性影響,通過生物學(xué)反應(yīng)試驗(yàn)證實(shí)了有效性和靈敏性。
【附圖說明】
[0015]圖1.利用本發(fā)明提供的方法測(cè)得的取食含不同濃度砷酸鉀(PA)、蛋白酶抑制劑(E-64)或雪花蓮凝集素(GNA)飼料的白符跳存活圖。
[0016]圖2.利用本發(fā)明提供的試驗(yàn)方法測(cè)得的取食含CrylC、Cry2A殺蟲蛋白和E-64飼料的白符跳生存曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]I毒性測(cè)定體系的構(gòu)建
[0018]下面說明本發(fā)明提供的檢測(cè)胃毒性殺蟲化合物(包括轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白如Bt蛋白)對(duì)土壤跳蟲白符跳潛在毒性影響的試驗(yàn)方法的【具體實(shí)施方式】。
[0019]白符跳飼料:建立測(cè)定殺蟲化合物對(duì)受試?yán)ハx的直接毒性,首先需要一個(gè)合適的昆蟲飼料,通過該飼料把殺蟲化合物飼喂給受試?yán)ハx。在該毒性測(cè)定體系中,所采用的飼料必須能滿足所測(cè)定昆蟲的正常生長(zhǎng)發(fā)育(一般要求存活率>80% ) (Romeis et al.,2011 ;Li et al.,2013)o通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),以酵母粉(梅山,河北馬利食品有限公司)作為飼料,白符跳的存活率>85% (圖1),滿足建立毒性測(cè)定體系的基本要求。
[0020]白符跳飼喂方法:把石膏:活性炭:水按9:1:10重量比混勻,適量倒入塑料培養(yǎng)皿(直徑:90mm ;高:15mm),室溫下凝固形成基底(3_5mm)。用毛筆小心的將新產(chǎn)的卵塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿內(nèi)。把培養(yǎng)皿置于人工氣候箱(RXZ-380A,寧波江南儀器廠)(溫度:20±1°C,相對(duì)濕度:70±5%,無光照)內(nèi)飼養(yǎng)。一般一星期后卵開始孵化,在蟲快孵化前在培養(yǎng)皿底部中央加入2mg酵母粉(梅山,河北馬利食品有限公司),每周更換酵母粉,同時(shí)加入適量水保持基底濕潤(rùn)。
[0021]生物測(cè)定試驗(yàn)方法:
[0022]生物測(cè)定實(shí)驗(yàn)中一般包括以下處理:
[0023]I)陰性對(duì)照組:酵母中不添加受試化合物;
[0024]2)處理組:酵母中按一定濃度(根據(jù)需要)均勻混入受試殺蟲劑或轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白;
[0025]3)陽性對(duì)照組:酵母中均勻混入E-64 (濃度一般為70-250 μ g/g酵母粉)。
[0026]把受試化合物如Bt蛋白或陽性對(duì)照化合物如E-64溶入適量蒸餾水中,然后把適量酵母粉混入溶液(酵母粉:溶液按1:5重量比),充分?jǐn)嚢韬?,真空冷凍干燥,分裝后置于_20°C冰箱待用。采用同樣的方法,將酵母粉按比例混入蒸餾水,冷凍干燥后置于-20°C冰箱保存,作為陰性對(duì)照飼料。一般選用10-12天白符跳蟲進(jìn)行生物測(cè)定試驗(yàn)。如上述方法,隨機(jī)選取10頭跳蟲置于培養(yǎng)皿中,將制備好的對(duì)照或殺蟲化合物處理飼料置于具有基底的培養(yǎng)皿(形成基底的方法與前面所述一樣)底部中央飼喂跳蟲。為了降低受試化合物的降解,保持受試殺蟲化合物的生物活性,飼料每隔2天更換一次。每個(gè)處理設(shè)5個(gè)重復(fù),共用50頭跳蟲。生物測(cè)定試驗(yàn)在培養(yǎng)箱(溫度:20±1°C,相對(duì)濕度:70±5%,光照:12:12H)中進(jìn)行。
[0027]試驗(yàn)持續(xù)28天,每天上午9點(diǎn)和下午9點(diǎn)觀察白符跳生長(zhǎng)發(fā)育,記錄跳蟲死亡率、產(chǎn)卵數(shù),并每隔7天測(cè)量跳
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