一種黃瓜棒孢葉斑病抗性鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明具體涉及內(nèi)容為黃瓜棒孢葉斑病離體抗性材料的鑒定方法，屬于植物保護(hù)
技術(shù)領(lǐng)域。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003] 由多主棒抱（引起的黃瓜棒抱葉斑?。–orynespora leafspot)是近年來(lái)黃瓜生產(chǎn)中危害較為嚴(yán)重的一種病害，該病害主要侵染黃瓜的葉片、 莖和果實(shí)。1906年歐洲首次報(bào)道黃瓜棒孢葉斑病，1957年美國(guó)北卡來(lái)羅納州報(bào)道該病發(fā) 生，1960年我國(guó)戚佩坤等報(bào)道了該菌在我國(guó)黃瓜上的寄生為害，隨后自2005年開(kāi)始在我國(guó) 許多黃瓜栽培地暴發(fā)，給農(nóng)民的生產(chǎn)帶來(lái)巨大的損失，成為黃瓜生產(chǎn)中的主要病害，據(jù)不完 全統(tǒng)計(jì)對(duì)農(nóng)民造成的經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)2億。
[0004] 對(duì)于黃瓜棒孢葉斑病的防治包括抗病品種選育、化學(xué)防治和生態(tài)防治等多方面， 抗病品種選育是最經(jīng)濟(jì)、有效、環(huán)保的措施。抗病性鑒定貫穿于抗病育種的全過(guò)程，是抗源 挖掘利用、抗病育種、抗性監(jiān)測(cè)等工作中重要一環(huán)。因此，準(zhǔn)確有效的抗病性鑒定方法是決 定抗病育種成敗的關(guān)鍵。
[0005] 在對(duì)黃瓜棒孢葉斑病抗性材料鑒定中，主要采用苗期人工接種的方法。苗期人工 接種鑒定在應(yīng)用過(guò)程中接種苗齡、接種方法、培養(yǎng)環(huán)境的不同及調(diào)查方式的不可控性，鑒定 結(jié)果往往具有差異。多主棒孢菌能夠產(chǎn)生寄主選擇性的毒素蛋白，該毒素溶液接種黃瓜葉 片可以直接感染產(chǎn)生病斑，因此可以其代替病原菌作為選擇壓力來(lái)鑒別和篩選抗病品種。 [0006]目前，多主棒孢毒素在橡膠棒孢葉斑病的抗病性鑒定中起到了很好的應(yīng)用，但在 黃瓜棒孢葉斑病的抗病性鑒定中應(yīng)用較少。目前，僅陸海寧、吳利民等在毒素對(duì)黃瓜抗、感 病品種的生理指標(biāo)影響、細(xì)胞壁損傷和相關(guān)抗性酶活性指標(biāo)變化上有過(guò)相關(guān)報(bào)道，而未形 成系統(tǒng)的以其應(yīng)用于黃瓜棒孢葉斑病的抗病性鑒定的方法 本發(fā)明對(duì)多主棒孢菌液體培養(yǎng)物經(jīng)提取純化后獲得其特異性的粗毒素濾液，在此基礎(chǔ) 上建立黃瓜棒孢葉斑病離體抗性材料快速鑒定方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 鑒于現(xiàn)有的黃瓜棒孢葉斑病苗期抗性鑒定方法的不足，以多主棒孢毒素在橡膠抗 病性鑒定中的應(yīng)用為參考，本發(fā)明提供一種操作鑒定、成本低、速度快、準(zhǔn)確性強(qiáng)、重復(fù)性 好、適應(yīng)于黃瓜抗病育種中的黃瓜棒孢葉斑病抗病性鑒定方法，以加速黃瓜棒孢葉斑病抗 病育種工作的開(kāi)展。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明"一種黃瓜棒孢葉斑病抗性鑒定方法"，包括以下步 驟： 以新鮮、健康、完整的黃瓜真葉作為侵染鑒定材料，該鑒定材料葉齡為黃瓜3片真葉時(shí) 期植株上的第2片真葉的離體葉片； 以無(wú)菌的多主棒孢（ca^iicoJa)毒素濾液為接種體，該接種體的獲得通 過(guò)以下步驟： 將活化的多主棒孢接種于Czapek液體培養(yǎng)基中，120rpm/min，搖床培養(yǎng)21d后，采用雙 層紗布過(guò)濾培養(yǎng)液，除去菌絲體，回收濾液，將回收到的濾液離心5000rpm/min，30min后， 收集上清液，采用〇. 45ym微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌，回收無(wú)菌濾液作為抗病性鑒定的接種 體； 將配得的無(wú)菌毒素濾液無(wú)損傷懸滴接種于新鮮、健康、完整的黃瓜離體葉片上，具體操 作是：在每個(gè)不同品種的離體葉片上無(wú)損傷懸滴接種4點(diǎn)，每點(diǎn)接種20ul的毒素濾液，并每 個(gè)待鑒定品種均以無(wú)損傷懸滴接種20ul無(wú)菌水為對(duì)照； 接種后，將葉片放置于培養(yǎng)托盤(pán)中保濕培養(yǎng)，在培養(yǎng)托盤(pán)底部平鋪兩層用15ml無(wú)菌水 浸濕的濾紙，并將黃瓜離體葉片的葉柄基部用被無(wú)菌水浸濕的醫(yī)用脫脂棉包裹，最后將塑 料托盤(pán)用保鮮袋覆蓋保濕； 將接種后的葉片25°C下培養(yǎng)3d后，觀察多主棒孢毒素對(duì)離體葉片的侵染情況，采用十 字交叉法測(cè)量接種葉片上的病斑直徑，通過(guò)葉片上侵染病斑的平均大小鑒定不同黃瓜品種 對(duì)多主棒孢的抗性。
[0009] 黃瓜棒孢葉斑病的抗性鑒定標(biāo)準(zhǔn)如下： 免疫（I)，侵染點(diǎn)無(wú)侵染； 高抗（HR)，侵染點(diǎn)發(fā)生侵染，出現(xiàn)褪綠變黃的小點(diǎn)，病斑直徑小于5_ ; 中抗（MR)，侵染點(diǎn)發(fā)生侵染，出現(xiàn)褪綠變黃的小點(diǎn)，病斑直徑5~10mm; 中感(MS)，侵染點(diǎn)發(fā)生侵染，出現(xiàn)褪綠變黃圓形病斑，病斑直徑10~15mm; 高感（HS)，侵染點(diǎn)發(fā)生侵染，出現(xiàn)褪綠變黃圓形病斑，病斑直徑大于15_。
[0010] 目前對(duì)于黃瓜棒孢葉斑病抗性鑒定常用的方法為苗期人工接種鑒定，在應(yīng)用過(guò)程 中該方法常因接種苗齡、接種方法、培養(yǎng)環(huán)境的不同及調(diào)查方式的不可控性，導(dǎo)致鑒定結(jié)果 具有一定的差異，而且鑒定結(jié)果的重復(fù)性低，不同批次間差異性較大。
[0011] 本發(fā)明所涉及的黃瓜棒孢葉斑病抗性鑒定方法克服了以上不足，鑒定結(jié)果只需3d 即可完成；且在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，對(duì)溫度、濕度均可進(jìn)行控制，環(huán)境因素影響小；操作方 法鑒定，可重復(fù)性高。該方法可實(shí)現(xiàn)高通量、快速鑒定不同品種黃瓜對(duì)棒孢葉斑病抗性的目 的。
[0012]
【具體實(shí)施方式】
[0013] 以下通過(guò)實(shí)施例形式對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容作詳細(xì)的說(shuō)明，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具 體的操作過(guò)程，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0014] 實(shí)施例1，不同商業(yè)黃瓜品種對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的抗性鑒定 發(fā)明施例中選擇的黃瓜抗棒孢葉斑病鑒定材料為：津優(yōu)3號(hào)，津優(yōu)38號(hào)為商業(yè)黃瓜品 種，購(gòu)于天津市科潤(rùn)黃瓜研究所；中農(nóng)5號(hào)，中農(nóng)8號(hào)為商業(yè)黃瓜品種，購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜花卉研究所。
[0015] 抗性鑒定方法如下： ①侵染鑒定材料的準(zhǔn)備：將供試的4個(gè)黃瓜品種播種于溫室營(yíng)養(yǎng)缽(營(yíng)養(yǎng)缽直徑12cm， 基質(zhì)成分為草炭：蛭石=1:2)中。當(dāng)黃瓜幼苗長(zhǎng)至3片真葉時(shí)期，取每株第2片真葉，作為 本發(fā)明方法應(yīng)用的鑒定材料。然后，對(duì)取走葉片的植株進(jìn)行苗期人工接種鑒定。
[0016] ②以無(wú)菌的多主棒孢（毒素濾液的制備：將活化的多主 棒孢接種于Czapek液體培養(yǎng)基中，120rpm/min，搖床培養(yǎng)21d后，采用雙層紗布過(guò)濾培養(yǎng) 液，除去菌絲體，回收濾液，將回收到的濾液離心5000rpm/min，30min后，收集上清