蛭石和珍珠巖作為根瘤菌與刺槐共生培養(yǎng)基質(zhì)的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物栽培技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及蛭石和珍珠巖作為根瘤菌與刺槐共生培 養(yǎng)基質(zhì)的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 根瘤菌是一類重要的農(nóng)業(yè)微生物，它們能與豆科植物共生形成根瘤，將大氣氮還 原為氨，為宿主植物提供所需的氮素營(yíng)養(yǎng)，這種共生體系是已知生物固氮能力最強(qiáng)的共生 體系之一，其每年的固氮量占全球生物固氮總量的50%以上，相當(dāng)于全世界工業(yè)合成氮肥 量的2倍，是全球氮素循環(huán)的主要環(huán)節(jié)。豆科植物作為一種重要的綠肥或生態(tài)保護(hù)植物，如 毛苕子、草木犀、紫穗槐、刺槐等，在恢復(fù)土壤生態(tài)、水土保持、提高土壤生產(chǎn)力等方面發(fā)揮 著重要的作用；作為經(jīng)濟(jì)作物，如大豆，它可為人類提供大量的植物蛋白和食用油，同樣，很 多豆科植物也是我國(guó)重要的中草藥，如黃芪、甘草、苦參等。因此，研究根瘤菌與豆科植物匹 配、建立高效共生固氮體系、提高氮素轉(zhuǎn)化效率、改善土壤質(zhì)量具有重要的指導(dǎo)意義，是農(nóng) 田土壤生態(tài)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展的迫切需求。
[0003] 全世界豆科植物約650屬，18000種，資源豐富，據(jù)報(bào)道可與豆科植物形成共生體 系的根瘤菌具有同樣多的種類，如何從種類繁多的豆科植物和根瘤菌中快速篩選和匹配高 效共生固氮體系是我們面臨巨大的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的方法是通過試管水培方法建立共生體系， 它克服了土培的連作障礙，對(duì)于觀察豆科植物根部結(jié)瘤與否及結(jié)瘤數(shù)量、大小及形態(tài)不需 要像基質(zhì)培養(yǎng)那樣取出植物。但在栽培過程中存在不少缺陷，主要表現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)液的濃度、溫 度、pH值等易產(chǎn)生劇烈變化，透氣性差，溶解氧低，根系環(huán)境穩(wěn)定性差。另外，對(duì)于體積、重 量較大的種子，如黃豆、蠶豆等，濾紙對(duì)于種子的支撐有時(shí)會(huì)有一定困難，并且容易受到外 界微生物的污染，影響共生體系的形成。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷和不足，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了蛭石與珍珠巖能提高根瘤菌和刺槐 的共生效率，與傳統(tǒng)的水培方法相比，不僅生成根瘤的時(shí)間短，而且根瘤數(shù)量明顯增多。該 基質(zhì)培養(yǎng)有效克服了水培過程中存在的缺點(diǎn)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，有利于快速建立共生體系。
[0005] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0006] 蛭石和珍珠巖作為根瘤菌與刺槐共生培養(yǎng)基質(zhì)的應(yīng)用。
[0007] 具體的，包括將蛭石和珍珠巖混合后作為基質(zhì)，采用基質(zhì)袋培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行根瘤菌 與刺槐的共生培養(yǎng)。
[0008] 更具體的，所述的蛭石的顆粒粒徑為1. 0~3. 0mm;所述的珍珠巖的顆粒粒徑為 1. 5~2. 5mm，按質(zhì)量比，輕石：珍珠巖=2:1。
[0009] 另外，所述的根瘤菌與刺槐的共生培養(yǎng)包括根瘤菌的活化、刺槐的催芽處理及將 活化的根瘤菌接種在催芽處理后的刺槐根部，將接種根瘤菌的刺槐在蛭石與珍珠巖的混合 基質(zhì)中進(jìn)行共生培養(yǎng)。
[0010] 同時(shí)，將根瘤菌接種在刺槐根部后的有效菌數(shù)為106~10 7CFU/mL。
[0011] 進(jìn)一步的，待刺槐具有第一片真葉時(shí)向刺槐的根基處接種根瘤菌。
[0012] 更進(jìn)一步的，將所述的蛭石與珍珠巖的混合基質(zhì)滅菌后再進(jìn)行根瘤菌與刺槐共生 的培養(yǎng)；
[0013] 所述的滅菌包括向基質(zhì)袋中倒入蛭石與珍珠巖的混合基質(zhì)，然后再向裝有混合 基質(zhì)的基質(zhì)袋中倒入無氮營(yíng)養(yǎng)液，最后將裝有混合基質(zhì)和無氮營(yíng)養(yǎng)液的基質(zhì)袋121°C滅菌 60min〇
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為：
[0015] (1)本發(fā)明通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用蛭石與珍珠巖一起作為混合基質(zhì)進(jìn)行刺槐與 根瘤菌的共生培養(yǎng)，與傳統(tǒng)的水培方法相比，不僅生成根瘤的時(shí)間短，而且得到的根瘤數(shù)量 明顯增多；
[0016] (2)本發(fā)明采用基質(zhì)袋培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行刺槐與根瘤菌的共生培養(yǎng)，大大的縮短了培 養(yǎng)周期，解決了水培技術(shù)中存在的營(yíng)養(yǎng)液的濃度、溫度、pH值等生長(zhǎng)環(huán)境參數(shù)易產(chǎn)生劇烈變 化，透氣性差，溶解氧低，根系環(huán)境穩(wěn)定性差等問題，同時(shí)，對(duì)于體積、重量較大的種子，如黃 豆、蠶豆等，解決了濾紙對(duì)于種子的支撐困難、容易受到外界微生物的污染及影響共生體系 形成的問題；
[0017] (3)本發(fā)明采用的蛭石和珍珠巖在121°C滅菌條件下不會(huì)發(fā)生性狀改變，有效的 改善了植物的生長(zhǎng)環(huán)境，防止外界微生物的污染，提高了刺槐_根瘤菌共生固氮能力，為科 研和實(shí)踐生產(chǎn)提供了新的途徑和技術(shù)。
【附圖說明】
[0018] 圖1基質(zhì)袋栽培與傳統(tǒng)試管水培方法中的根瘤數(shù)量，其中黑體正方形代表的是基 質(zhì)袋方法，實(shí)心圓圈代表的是試管水培方法；
[0019] 圖2基質(zhì)袋栽培與傳統(tǒng)試管水培方法中的植物地上部分干重；
[0020] 以下結(jié)合說明書附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做具體說明。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 本發(fā)明采用的蛭石為顆粒狀，其顆粒大小為1. 0~3. 本發(fā)明采用的珍珠巖為 顆粒狀，其顆粒大小為1. 5~2. 5mm。
[0022] 本發(fā)明采用如下方法實(shí)現(xiàn)：
[0023] (1)凍存根瘤菌的活化：應(yīng)用YMA平板培養(yǎng)基。
[0024] (2)刺槐的催芽處理：取刺槐種子95%濃硫酸浸泡，期間慢速攪拌，8-10分鐘后小 心去掉硫酸并用大量無菌水快速?zèng)_洗，再加入95%乙醇浸泡1-2分鐘后，蒸餾水沖洗6次。 同時(shí)，配制1 %水瓊脂培養(yǎng)基，將種子均勻放入冷凝后的水瓊脂培養(yǎng)基上。然后將培養(yǎng)皿放 入30攝氏度培養(yǎng)箱中催芽約2天。
[0025] (3)育苗容器及基質(zhì)制備：在基質(zhì)培養(yǎng)中，蛭石與珍珠巖以2:1 (質(zhì)量比）混合裝 基質(zhì)袋。配制6L左右無氮營(yíng)養(yǎng)液，每袋基質(zhì)袋中倒入約300ml，然后向事先準(zhǔn)備洗凈的大試 管中分別倒入約60ml無氮營(yíng)養(yǎng)液。
[0026](4)實(shí)驗(yàn)處理如表1，共4個(gè)處理。將長(zhǎng)度約為1cm發(fā)芽的刺槐苗，在無菌的條件 下定植于基質(zhì)袋和大試管中，待第一片真葉長(zhǎng)出時(shí)，向植物根基處接l〇ml菌，接菌后有效 菌數(shù)為（1〇6~10 7)CFU/mL。接菌后，每4天檢測(cè)空白對(duì)照中細(xì)菌和所有處理真菌變化情況， 整個(gè)栽培周期為36天。
[0027] 表1六種培育組的制備數(shù)量
[0028]
[0029] 注：其中植物組是在基質(zhì)袋中植入催芽后的刺槐，植物加菌組是在基質(zhì)袋中植入 催芽后的刺槐并向其根部加lml根瘤菌液
[0030] (5)檢測(cè)內(nèi)容：植物結(jié)瘤最早時(shí)間，根瘤數(shù)量；植物地上部分干重測(cè)定；采用梯度 稀釋平板技術(shù)法檢測(cè)不同共生培養(yǎng)技術(shù)細(xì)菌和真菌變化。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明處理數(shù)據(jù)可得出結(jié)論，基質(zhì)袋培養(yǎng)技術(shù)中的刺槐地上干重明顯高于水 培技術(shù)，結(jié)瘤早于水培，接菌第8天就觀察到根瘤形成，水培技術(shù)中第12天出現(xiàn)少量根瘤， 在基質(zhì)培養(yǎng)過程中，基質(zhì)培養(yǎng)結(jié)瘤數(shù)多。基質(zhì)培雜菌污染率較小，水培在培養(yǎng)到第24天時(shí) 開始出現(xiàn)霉菌，在第36天時(shí)，幾乎所有水培都出現(xiàn)了霉菌，而基質(zhì)培養(yǎng)在細(xì)菌檢測(cè)中始終 沒有霉菌出現(xiàn)。
[0032] 綜合分析，基質(zhì)袋培養(yǎng)的共生體系形成快，結(jié)瘤效率遠(yuǎn)高于水培，基質(zhì)培養(yǎng)中，植 物雜菌污染率較小，培養(yǎng)過程中沒有霉菌出現(xiàn)，而水培則在培養(yǎng)到第24天時(shí)就出現(xiàn)了霉 菌，基質(zhì)中的植物干重統(tǒng)計(jì)結(jié)果總體高于水培，故基質(zhì)培可作為實(shí)驗(yàn)室替代水培的一種新 型的培養(yǎng)方式。
[0033] 下面通過具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步具體的說明。
[0034] 實(shí)施例一：
[0035] 1 材料：
[0036] 1. 1供試基質(zhì)：蛭石和珍珠巖均購自鑫方試劑公司，蛭石的粒徑為1. 0~3. 0mm ; 珍珠巖的粒徑為1. 5~2. 5mm。
[0037] 1. 2基