r>[0040](3)增殖培養(yǎng):在超凈工作臺上，將處理過的帶腋芽莖段取出，無菌水沖洗4-5遍，再用無菌濾紙吸干殘留水分，接種于MS+8.0g/L瓊脂+30.0g/L鹿糖+3.0mg/L 6-BA+0.lmg/L NAA的培養(yǎng)基中，注意形態(tài)學上端朝上插入培養(yǎng)基，在溫度25°C，光強為15001x組培專用LED燈下光照16h，直到長出大量腋芽。
[0041](4)生根培養(yǎng):為了快速繁殖并獲得大量植株，將腋芽切出，接種于1/2MS+8.0g/L瓊脂+30.0g/L蔗糖+0.2mg/L 2，4_D培養(yǎng)基中生根生長。
[0042](5)倍性檢測:培養(yǎng)約一個月，取嫩葉制樣在流式細胞儀上檢測所獲得株系的倍性，此時的誘變率能達27.3%。
[0043]具體步驟為:
[0044]I)取約0.5g葉片放在預冷的培養(yǎng)皿中，加入Iml預冷的Ottol，用鋒利的刀片一次性快速切碎；
[0045]2)吸取培養(yǎng)皿中的解離液，用400目濾膜過濾到1.5ml離心管中，于4°C冰箱孵育5min ；
[0046]3)離心，轉速 1000r/min，溫度 4°C，時間 5min ;
[0047]4)棄去上清液，加入預冷的OttoI 20μ1，再加入OttoII 80 μ 1，最后加入100 μ I預冷的碘化丙啶PI染液，每個樣共約200 μ I細胞核懸浮液，置于4°C冰箱，避光染色1min ；
[0048]5)移至上樣管，上機檢測。
[0049]OttoI 的組成為:0.lmol/L 檸檬酸，0.5% (v/v) Tween20, pH 2.0-3.0，4°C保存；OttoII的組成為:0.4mol/L十二水磷酸氫二鈉，pH 2.0-3.0，常溫保存；PI (碘化丙啶)染液濃度為0.05mg/ml，每ml加入250 μ g RNA酶，錫紙包裹，避光，4°C保存。
[0050]用Otto’ s提取PI染色后，顯微鏡下觀察到的細胞核如圖3所示。
[0051](6)擴繁:將已確定了的倍性增加植株大量擴繁，切成莖段，在1/2MS+8.0g/L瓊脂+30.0g/L蔗糖+0.2mg/L 2，4_D培養(yǎng)基中培養(yǎng)，保存無菌苗。
[0052]圖1A為流式細胞儀檢測東南景天葉片相對DNA含量分布直方圖；圖1B為流式細胞儀檢測加倍東南景天葉片相對DNA含量分布直方圖。
[0053]圖2為東南景天植株比較圖，圖2A為對照植株形態(tài)圖，圖2B為倍性增加植株形態(tài)圖。
[0054]利用流式細胞儀對植物細胞倍性進行檢測，對照植物有四個峰，說明未經秋水仙素加倍的東南景天本身體內含有四種DNA含量的細胞，即其本身就是混倍體。對變異株進行DNA含量測定，發(fā)現有五個峰，染色體的倍性增加，但其仍是混倍體。在外部形態(tài)上，變異株比對照的莖桿粗壯，葉片厚實，根系發(fā)達。組培條件下倍性增加的苗明顯壯于對照苗，生物量大。組培條件下，同高度的苗，倍性增加苗的重量約是對照的2-3倍。
[0055]圖5A為Tris.MgCl2提取劑提取、PI染液染色后流式細胞儀檢測東南景天葉片相對DNA含量分布直方圖，圖5B為Tris.MgCl2提取劑提取、PI染液染色后流式細胞儀檢測加倍東南景天葉片相對DNA含量分布直方圖。用Tris.MgCl2提取劑提取，用PI染色，經流式細胞儀分析，有些峰不是很明顯，且有很多的背景碎片。相比，Otto’ s提取方法效果更好。
[0056]Tris.MgCl2:0.2mol/L Tris，4mmol/L 六水氯化鎂，0.5% (v/v) Triton X-100，pH
7.5，4°C保存。
[0057]實施例2
[0058](I)鎘處理:選擇長勢相同的倍性增加苗與對照，移入MS+8.0g/L瓊脂+30.0g/L蔗糖+0.2mg/L 2，4-D培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中鎘的濃度分別為0，50，100, 200 μ M，每個處理三次重復。
[0059](2)收樣:試驗處理30d后收獲取樣。收獲植物時，將植物置于20mM Na2EDTA溶液交換15分鐘，去除表面吸附的Cd'然后用自來水和去離子水分別洗三次。
[0060](3)鎘含量測定:將收取的植物置于105°C下殺青30min，然后在65°C下烘干至恒重；用研缽將植物樣品磨細，供元素分析測定用。稱取0.1g植物干燥粉末，使用HN03/HC104雙酸法進行消煮。消煮后的溶液用去離子水定容后，使用ICP-MS(Agilent 7500a)進行鎘含量測定。
[0061]圖4為鎘脅迫下東南景天對照植株與倍性增加植株體內鎘含量。
【主權項】
1.一種提高超積累植物東南景天對重金屬超積累能力的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)將離體的東南景天植株切成含有完整腋芽的莖段，浸入無菌秋水仙素溶液中，密封避光，并放入溫度為25°C ±1°C的搖床中振蕩； (2)取出步驟(I)處理后的離體帶腋芽莖段，經無菌水沖洗后接種于分化培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至腋芽處長出叢生芽； (3)將所得的叢生芽接種于生根培養(yǎng)基中，進行生根培養(yǎng)； (4)取生根培養(yǎng)后的完整植株的嫩葉在流式細胞儀上檢測所獲得株系的倍性，選擇變異植株； (5)取變異植株，切成莖段，在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得無菌苗。2.根據權利要求1所述提高超積累植物東南景天對重金屬超積累能力的方法，其特征在于，所述秋水仙素溶液的質量濃度為0.1-0.2%。3.根據權利要求1所述提高超積累植物東南景天對重金屬超積累能力的方法，其特征在于，步驟(I)中在搖床中震蕩培養(yǎng)20?24h。4.根據權利要求1所述提高超積累植物東南景天對重金屬超積累能力的方法，其特征在于，所述分化培養(yǎng)基的組成為:基礎培養(yǎng)基MS+8.0g/L瓊脂+30.0g/L蔗糖+3.0mg/L6-BA+0.lmg/L NAA, pH 5.805.根據權利要求1所述提高超積累植物東南景天對重金屬超積累能力的方法，其特征在于，所述生根培養(yǎng)基的組成為:l/2MS+8.0g/L瓊脂+30.0g/L蔗糖+0.2mg/L 2，4_D，ρΗ5.8ο6.根據權利要求1所述提高超積累植物東南景天對重金屬超積累能力的方法，其特征在于，步驟(4)中倍性檢測的方法包括如下步驟: (1)取嫩葉片放在預冷的培養(yǎng)皿中，加入預冷的Ottol，切碎，解離； (2)吸取步驟(I)培養(yǎng)皿中的解離液，用400目濾膜過濾到離心管中，于3?5°C孵育3 ?5min ； (3)離心棄去上清液，加入預冷的Ottol，再加入OttoII，最后加入預冷PI染液，置于3?5°C條件下避光染色8?1min ;0ttol、OttoII和PI染液的體積比為1:4:5 ; (5)移至上樣管，上流式細胞儀檢測。7.根據權利要求6所述提高超積累植物東南景天對重金屬超積累能力的方法，其特征在于，所述 OttoI 的組成為:0.lmol/L 梓檬酸，0.5 % (v/v) Tween20，pH 2.0-3.0 ;所述OttoII的組成為:0.4mol/L十二水磷酸氫二鈉，pH 2.0-3.0。8.根據權利要求6所述提高超積累植物東南景天對重金屬超積累能力的方法，其特征在于，所述PI染液的濃度為0.05mg/ml，每ml染液加入250 μ g RNA酶。9.根據權利要求1所述提高超積累植物東南景天對重金屬超積累能力的方法，其特征在于，當步驟(3)中的植株長到5cm高后，上流式細胞儀上檢測檢測。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高超積累植物東南景天對重金屬超積累能力的方法，包括：將離體的東南景天植株切成含有完整腋芽的莖段，浸入無菌秋水仙素溶液中，密封避光，并放入溫度為25℃±1℃的搖床中振蕩；取出處理后的離體帶腋芽莖段經無菌水沖洗后接種于分化培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至腋芽處長出叢生芽；將叢生芽接種于生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)為完整植株；取完整植株的嫩葉在流式細胞儀上檢測所獲得株系的倍性，選擇變異植株；取變異植株，切成莖段，在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得無菌苗；變異植株與對照株在加鎘的培養(yǎng)基中進行鎘處理，檢測其體內鎘積累量。本發(fā)明通過誘導東南景天染色體加倍，再經過檢測獲得加倍材料，提高東南景天對重金屬的超積累能力。
【IPC分類】A01H4/00, A01H1/08
【公開號】CN105104184
【申請?zhí)枴緾N201510537381
【發(fā)明人】馮英, 孟茜, 潘鳳山, 羅莎, 馬曉曉, 王瓊, 楊肖娥
【申請人】浙江大學
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年8月28日