一種玉米灰斑病的接種方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物灰斑病的接種方法，具體涉及一種玉米灰斑病的接種方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 玉米灰斑病是玉米生產(chǎn)區(qū)主要病害之一，隨著灰斑病在玉米生產(chǎn)造成的危害逐年 加重，對(duì)于玉米灰斑病的研究也在不斷深入。近年來，針對(duì)玉米灰抗斑病的研究主要涵蓋了 灰斑病致病機(jī)理研究、病原菌致病性研究、植株抗病性鑒定及抗性基因定位及克隆等方面， 上述研究的開展均依賴賴于通過自然接種或人工接種方式來實(shí)現(xiàn)病原菌對(duì)玉米植株進(jìn)行 侵染，進(jìn)而引發(fā)病害，從而便于研究人員跟蹤調(diào)查發(fā)病全程。
[0003]目前，玉米灰斑病的發(fā)生對(duì)氣溫和空氣濕度有較高要求，自然接種和人工接種的 方式均存在各自的不足，因而不能完全滿足試驗(yàn)的要求。其中，自然接種是在玉米灰斑病流 行區(qū)域內(nèi)種植待接種的玉米材料，待環(huán)境溫度及相對(duì)濕度適宜時(shí)，由殘留在環(huán)境中的灰斑 病病原菌對(duì)鑒定材料進(jìn)行侵染進(jìn)而引發(fā)病害。自然接種侵染植株受到季節(jié)、地域及年度病 害流行情況等因素限制，只能夠在符合玉米生長(zhǎng)的特定季節(jié)（如春、夏季）及適宜該病害發(fā) 生的地域內(nèi)進(jìn)行田間鑒定。該接種方法對(duì)于空氣溫度和相對(duì)濕度無法調(diào)控，從而影響接種 效果；同時(shí)自然接種試驗(yàn)人員無法準(zhǔn)確掌握接種時(shí)間及侵染發(fā)生時(shí)間，無法觀察收集接種 前與接種后特定時(shí)間節(jié)點(diǎn)被侵染植株在生理生化指標(biāo)上的變化。人工接種需要對(duì)灰斑病病 原菌進(jìn)行人工分離、培養(yǎng)，在大田或大棚環(huán)境條件下，通過人工噴施、注射帶菌液或接入帶 菌載體到植株體的方式完成接種，并誘發(fā)植株發(fā)病，該接種方法雖能夠準(zhǔn)確掌控接種時(shí)間， 也能夠通過病原菌分離培養(yǎng)步驟獲得純化后灰斑病病原菌，但人工接種侵染植株受到季節(jié) 和地域的限制，只能夠在符合玉米生長(zhǎng)的特定季節(jié)（如春、夏季）進(jìn)行田間鑒定，面臨植株 接種后空氣溫度和相對(duì)濕度變化無法調(diào)控影響，接種寄主難以發(fā)病，接種成功率不高的問 題；此外，灰斑病病原菌人工條件下生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)期間易受污染也是限制人工接種成功率 的原因之一。
[0004] 因此，如何提高玉米灰斑病的接種成功率，為灰斑病研究提供一種穩(wěn)定可靠（不 受季節(jié)、外部環(huán)境和地域等因素的限制）的可控制接種時(shí)間的高成功率地人工接種方法成 為了一個(gè)亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種穩(wěn)定可靠的玉米灰斑病可控制接種時(shí)間 的高成功率地人工接種方法。
[0006] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是，一種玉米灰斑病的接種方法，包括以 下步驟：
[0007] (1)喇叭口期玉米植株移栽：將喇叭口期玉米植株（優(yōu)選小喇叭口期玉米植株） 帶土移栽至直徑40~60cm，深50~70cm的花盆中；
[0008] (2)模擬環(huán)境下培養(yǎng)：將移植植株放置于人工氣候培養(yǎng)箱中，設(shè)定環(huán)境溫度為 20~30°C (優(yōu)選25°C )，相對(duì)濕度為90~100% (優(yōu)選95% )，白晝時(shí)間11~13h(優(yōu)選 12h)，光照強(qiáng)度2000~3000Lx (優(yōu)選2500Lx)，黑夜時(shí)間為11~13h (優(yōu)選12h)，光照強(qiáng)度 為OLx，人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)植株7~IOd (優(yōu)選9d)，待植株恢復(fù)正常生長(zhǎng)；
[0009] (3)病原菌收集：對(duì)灰斑病典型病斑葉進(jìn)行水浸泡、水洗脫與離心方式，在短時(shí)間 內(nèi)獲得具有高濃度的灰斑病帶菌液；
[0010] (4)接種：先用清水沖洗待接種的葉片，晾干后再撒上少許500~700目金剛砂， 在接種葉片上輕輕摩擦，要求僅使葉片表皮細(xì)胞造成微傷口而不死亡，每天涂抹1~3次， 連續(xù)涂抹2~4d，每次涂抹后以保鮮膜覆蓋涂抹菌液部分，保濕3~4d后去掉保鮮膜，以起 到保濕作用。
[0011] 進(jìn)一步，步驟（3)中，所述水浸泡是用50ml蒸餾水浸泡20g具有灰斑病典型病斑 的葉片，浸泡4h，過濾葉片殘?jiān)?，收集浸泡蒸餾水；所述水洗脫是用新的蒸餾水反復(fù)洗脫浸 泡后的病斑葉片3~4次，每次用水量50ml，洗脫后收集蒸餾水備用；所述離心是將浸泡病 斑的蒸餾水以6500~7000rap/min轉(zhuǎn)速離心15~25min，去掉離心管內(nèi)上清液，保留底部 沉淀，重復(fù)離心多次，直至洗脫液全部被離心；最后收集離心管底部沉淀，將其置入Iml蒸 餾水中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，即得帶菌懸濁液?br>[0012] 本發(fā)明通過人工氣候培養(yǎng)箱真實(shí)模擬出灰斑病發(fā)病所需要的最佳環(huán)境（最適接 種環(huán)境溫度、相對(duì)濕度及光照強(qiáng)度），在模擬環(huán)境中以高濃度病原菌懸濁液涂抹對(duì)玉米植株 進(jìn)行灰斑病人工接種。因此，本發(fā)明不受季節(jié)、外部環(huán)境和地域等因素的限制，有效地提高 了灰斑病人工接種的成功率，能夠準(zhǔn)確控制灰斑病的接種時(shí)間，有利于觀察和檢測(cè)植株在 接種前后特定時(shí)間節(jié)點(diǎn)的外觀及內(nèi)部指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化。
[0013] 實(shí)踐證明，玉米灰斑病病株率可達(dá)95.0%。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0015] 實(shí)施例1 :
[0016] 1、玉米灰斑病的接種方法
[0017] (1)喇叭口期玉米植株移栽：將小喇叭口期玉米植株帶土移栽至直徑50cm，深 60cm的花盆中；
[0018] (2)在人工氣候培養(yǎng)箱模擬環(huán)境下培養(yǎng)：將移植植株放置于人工氣候培養(yǎng)箱中， 設(shè)定環(huán)境溫度為25°C，相對(duì)濕度為95%，白晝時(shí)間12h，光照強(qiáng)度2500Lx，黑夜時(shí)間為12h， 光照強(qiáng)度為〇Lx，人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)植株9天，待植株恢復(fù)正常生長(zhǎng)。
[0019] (3)病原菌收集：①首選水浸泡：用50ml蒸餾水浸泡20g具有灰斑病典型病斑的 葉片，浸泡4h，過濾葉片殘?jiān)?，收集浸泡蒸餾水；②接著水洗脫：用新的蒸餾水反復(fù)洗脫浸 泡后的病斑葉片3~4次，每次用水量50ml，洗脫后收集蒸餾水備用；③然后離心：將浸泡 病斑的蒸餾水以6700rap/min轉(zhuǎn)速離心20min，去掉離心管內(nèi)上清液，保留底部沉淀，重復(fù) 離心多次，直至洗脫液全部被離心；④最后收集離心管底部沉淀，將其置入Iml蒸餾水中， 充分?jǐn)嚢杈鶆?，即得濃度? X IO5個(gè)/微升帶菌懸濁液。
[0020] (4)接種：先用清水沖洗待接種的葉片，晾干后再撒上少許金剛砂（600目），以左 手托著葉片，用右手食指蘸取少量灰斑菌懸液。在接種葉片上輕輕摩擦，要求僅使葉片表皮 細(xì)胞造成微傷口而不死亡。每天涂抹2次，連續(xù)涂抹3d，每次涂抹后以保鮮膜覆蓋涂抹菌液 部分，保濕3~4d后可去掉保鮮膜。
[0021] 2、發(fā)病情況調(diào)查
[0022] 保持人工氣候培養(yǎng)箱的溫濕度及光照強(qiáng)度在合適的范圍，大喇叭口期移栽玉米至 人工氣候培養(yǎng)箱，根據(jù)玉米植株生長(zhǎng)狀態(tài)及時(shí)進(jìn)行肥水管理，待玉米植株恢復(fù)正常生長(zhǎng)后 人工接種。接種后15d左右可以通過肉眼觀察到接種葉片出現(xiàn)典型病斑，玉米灰斑病發(fā)病 情況調(diào)查結(jié)果見表1 (三次重復(fù)數(shù)據(jù)）。
[0023] 表1玉米灰斑病發(fā)病情況
[0025] 3、寄主發(fā)病效果對(duì)照數(shù)據(jù)
[0026] 分別比較了三種接種方法（A :海拔600m的大田環(huán)境人工接種；B :海拔1500m的自 然接種；C :海拔600m的大喇叭口期移栽后人工氣候培養(yǎng)箱條件下人工接種）下的玉米灰 斑病發(fā)病情況，每種方法設(shè)三次重復(fù)。玉米灰斑病發(fā)病情況見表2。
[0027] 表2玉米灰斑病發(fā)病情況
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種玉米灰斑病的接種方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 喇叭口期玉米植株移栽：將喇叭口期玉米植株帶土移栽至直徑40~60cm，深50~ 70cm的花盆中； (2) 模擬環(huán)境下培養(yǎng)：將移植植株放置于人工氣候培養(yǎng)箱中，設(shè)定環(huán)境溫度為20~ 30°C，相對(duì)濕度為90~100%，白晝時(shí)間11~13h，光照強(qiáng)度2000~3000Lx，黑夜時(shí)間為 11~13h，光照強(qiáng)度為OLx，人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)植株7~10d，待植株恢復(fù)正常生長(zhǎng)； (3) 病原菌收集：對(duì)灰斑病典型病斑葉進(jìn)行水浸泡、水洗脫與離心方式，在短時(shí)間內(nèi)獲 得具有高濃度的灰斑病帶菌液； (4) 接種：先用清水沖洗待接種的葉片，晾干后再撒上少許500~700目金剛砂，在接 種葉片上輕輕摩擦，要求僅使葉片表皮細(xì)胞造成微傷口而不死亡，每天涂抹1~3次，連續(xù) 涂抹2~4d，每次涂抹后以保鮮膜覆蓋涂抹菌液部分，保濕3~4d后去掉保鮮膜。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米灰斑病的接種方法，其特征在于，步驟（1)中，所述喇叭 口期玉米植株為小喇叭口期玉米植株。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的玉米灰斑病的接種方法，其特征在于，步驟⑵中，所述 設(shè)定環(huán)境溫度為25°C，相對(duì)濕度為95%，白晝時(shí)間12h，光照強(qiáng)度2500Lx，黑夜時(shí)間為12h， 光照強(qiáng)度為〇Lx，人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)植株9d。4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3之一所述的玉米灰斑病的接種方法，其特征在于，步驟（3)中， 所述水浸泡是用50ml蒸餾水浸泡20g具有灰斑病典型病斑的葉片，浸泡4h，過濾葉片殘?jiān)?收集浸泡蒸餾水；所述水洗脫是用新的蒸餾水反復(fù)洗脫浸泡后的病斑葉片3~4次，每次用 水量50ml，洗脫后收集蒸餾水備用；所述離心是將浸泡病斑的蒸餾水以6500~7000rap/ min轉(zhuǎn)速離心15~25min，去掉離心管內(nèi)上清液，保留底部沉淀，重復(fù)離心多次，直至洗脫液 全部被離心；最后收集離心管底部沉淀，將其置入Iml蒸餾水中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，即得帶?懸濁液。
【專利摘要】一種玉米灰斑病的接種方法，包括以下步驟：(1)喇叭口期玉米植株移栽；(2)在人工氣候培養(yǎng)箱真實(shí)模擬環(huán)境下培養(yǎng)；(3)病原菌收集；4)接種。本發(fā)明不受季節(jié)、外部環(huán)境和地域等因素的限制，有效地提高了灰斑病人工接種的成功率，能夠準(zhǔn)確控制灰斑病的接種時(shí)間，有利于觀察和檢測(cè)植株在接種前后特定時(shí)間節(jié)點(diǎn)的外觀及內(nèi)部指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化。
【IPC分類】A01G1/00
【公開號(hào)】CN105123175
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510434473
【發(fā)明人】何文鑄, 張彪, 楊麟, 冷益豐, 蘭海, 陳潔, 李蘆江, 譚君, 徐國(guó)倫, 楊俊品, 蔡明鴻, 康繼偉, 黃維藻, 唐海濤, 李政, 何遠(yuǎn)遠(yuǎn)
【申請(qǐng)人】四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所
【公開日】2015年12月9日
【申請(qǐng)日】2015年7月22日