鐵皮石斛組培一步成苗批量化生產(chǎn)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于鐵皮石斛的組培技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鐵皮石斛組培苗一步成苗批量化生產(chǎn)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)為蘭科石斛，屬多年生草本植物。鐵皮石斛的藥用與保健價(jià)值極高，“鐵皮石斛”一詞始出自《神農(nóng)本草經(jīng)》，國(guó)際藥用植物界稱其為“藥界大熊貓”;被民間稱作“救命仙草”?，F(xiàn)代臨床應(yīng)用和藥理研究證實(shí)，鐵皮石斛具有滋陰潤(rùn)肺、養(yǎng)胃生津、健腦明目、保肝寧心、清熱降火、補(bǔ)五臟之虛勞、輕身延年的神奇功效。對(duì)慢性疲勞綜合癥、肺病、冠心病、腎病、慢性肝病、高血壓、高血脂、高血糖、糖尿病、慢性胃病、干燥綜合癥、癌癥等疾病都有確切療效和調(diào)理康復(fù)作用?？稍鰪?qiáng)肌體免疫力、抗氧化、抗衰老，對(duì)煙酒過(guò)度、勞累過(guò)度、夜生活過(guò)度、用眼用腦過(guò)度、聲音嘶啞、口干舌燥等康復(fù)有特殊療效。
[0003]鐵皮石斛的種子極小、無(wú)胚乳，每粒種子只有3 -4個(gè)細(xì)胞，自然條件下需與某些真菌共生才能萌發(fā)，很難用實(shí)生苗栽培；而傳統(tǒng)的分株、扦插等方式的繁殖率極低，加上人為的過(guò)度采挖和生態(tài)環(huán)境的破壞，其資源已瀕臨滅絕。鐵皮石斛組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)是解決鐵皮石斛大面積栽培用苗的一個(gè)最有效的途徑。
[0004]近年來(lái)，科研工作者對(duì)鐵皮石斛組織培養(yǎng)快速繁殖進(jìn)行了大量產(chǎn)業(yè)化技術(shù)研究，但是大部分采用外植體一原球莖誘導(dǎo)一分化一壯苗一生根一移栽的途徑進(jìn)行工廠化生產(chǎn)，培養(yǎng)程序特別繁瑣；另外，培養(yǎng)基需添加特殊成份，才能獲得優(yōu)質(zhì)健壯的種苗。如最新的鐵皮石斛中國(guó)專利201310681992.4^201310699964.5^201410113720.9等，除基本培養(yǎng)基和激素外，還需添加香蕉汁、或馬鈴薯汁、或脯氨酸、或水解酪蛋白、或茶多酚、或活性炭等其它成份，才能獲得健壯的試管苗，以至于市場(chǎng)上鐵皮石斛組培苗價(jià)格高，至少要15元/瓶。種植戶買不起優(yōu)質(zhì)種苗，從而制約了鐵皮石斛優(yōu)質(zhì)種苗產(chǎn)業(yè)化推廣。因此，本發(fā)明致力于開發(fā)一種高效、低成本的培養(yǎng)體系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)鐵皮石斛的組織培養(yǎng)培養(yǎng)程序繁瑣、成本高的問(wèn)題，本發(fā)明目的是提供一種繁殖周期短、成本低的鐵皮石斛高效低耗量的組織培養(yǎng)方法。本發(fā)明方法非常適合工業(yè)化生產(chǎn)，而且達(dá)到產(chǎn)業(yè)化水平。
[0006]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)的:
[0007]鐵皮石斛組培一步成苗批量化生產(chǎn)的方法，包括以下步驟:
[0008](I)原球莖的繁殖:選擇優(yōu)良鐵皮石斛植株的頂芽或腋芽為外植體，外植體消毒后在 MS+6-BA0.1 ?3.0mg/L+KT0.2 ?1.0mg/L+IAA0.1 ?1.0mg/L+NAA0.2 ?2.0mg/L+ 矮壯素0.01?0.5mg/L瓊脂固體培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)原球莖的同時(shí)分化出健壯芽；
[0009](2) 一步成苗批量化生產(chǎn):將步驟⑴獲得的帶芽原球莖直接轉(zhuǎn)入MS+6-BA0.2?1.0mg/L+IAA0.2 ?0.5mg/L+NAA0.1 ?2.0mg/L+ 矮壯素 0.5 ?2.0mg/L 的瓊脂固體培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖、分化、壯苗和生根；
[0010](3)試管苗移栽。
[0011]步驟(I)中將外植體剪成0.5-lcm長(zhǎng)含有I節(jié)I芽(即至少含有一個(gè)頂芽或者腋芽的莖段)的規(guī)格。
[0012]步驟(I)外植體消毒過(guò)程:首先用洗衣粉清洗干凈，在無(wú)菌操作臺(tái)上用無(wú)菌水洗5?7次，用70%酒精浸潤(rùn)30秒?I分鐘，再放入0.1 %的升汞溶液中滅菌8?15分鐘，無(wú)菌水沖洗5?6次，備用。
[0013]步驟(I)優(yōu)選使用的培養(yǎng)基:MS+6-BA2.0mg/L+KT0.5mg/L+IAA0.25mg/L+NAA0.5mg/L+ 矮壯素 0.lmg/L ;或者優(yōu)選使用培養(yǎng)基:MS+6_BA1.5mg/L+KT0.5mg/L+1AA0.3mg/L+NAA0.4mg/L+ 矮壯素 0.3mg/L。
[0014]步驟(I)誘導(dǎo)出的原球莖繼續(xù)繼代培養(yǎng)，每隔40?50d繼代一次。
[0015]步驟⑵優(yōu)選使用的培養(yǎng)基:MS+6-BA0.3mg/L+IAA0.3mg/L+NAA0.4mg/L+ 矮壯素
0.6mg/L ;或者優(yōu)選使用培養(yǎng)基:MS+6-BA0.5mg/L+IAA0.2mg/L+NAA0.6mg/L+ 矮壯素 0.9mg/L0
[0016]步驟⑵培養(yǎng)時(shí)每隔35?45d出苗一次。
[0017]步驟(I)和(2)的培養(yǎng)溫度為24°C ±2，1000?20001x環(huán)境中，每天10?12小時(shí)光照培養(yǎng)。
[0018]步驟(3)試管苗移栽具體過(guò)程:試管苗出瓶移栽前，將根葉倶全的瓶苗，放置室外煉苗5-7d，隨后取出清洗根部培養(yǎng)基，將幼苗移栽至栽培基質(zhì)中，栽培基質(zhì)中質(zhì)量比例苔蘚:樹皮:蛭石=5:3:1，在溫度為20?28°C，空氣濕度80?90%的條件下生長(zhǎng)，30?40d長(zhǎng)出新葉時(shí)，即已成活。
[0019]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:
[0020]1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處，本發(fā)明通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)短期內(nèi)獲得大量原球莖，增殖倍數(shù)達(dá)到22-45，一般增殖倍數(shù)在5-20之間；現(xiàn)有的組培方法生長(zhǎng)的原球莖一般都要切割，而采用本發(fā)明方法和培養(yǎng)基則獲得的原球莖不用切割，直接轉(zhuǎn)瓶(可通過(guò)圖2看出長(zhǎng)出的一株株單獨(dú)的原球莖，是無(wú)需采用工具分割開的)，方法極其簡(jiǎn)單，可以節(jié)約接種工的生產(chǎn)成本。
[0021]2、根據(jù)前人的研究，鐵皮石斛的組織培養(yǎng)主要采用外植體一原球莖(誘導(dǎo)培養(yǎng))一分化幼苗(分化培養(yǎng))一壯苗(壯苗培養(yǎng))一生根(生根培養(yǎng))一移栽(移栽培養(yǎng))等多個(gè)培養(yǎng)程序完成，至少需要120d。本發(fā)明培養(yǎng)程序分兩步完成，首先提高原球莖增殖倍數(shù)，加快基礎(chǔ)苗的繁殖(增殖倍數(shù)達(dá)22-45)，在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)；其次，批量化生產(chǎn)階段原球莖同步增殖分化壯苗和生根，將培養(yǎng)程序中四步簡(jiǎn)化為一步完成，即“一步成苗”方法，形成完整植株只需35-45天，節(jié)約了 60?80d時(shí)間獲得優(yōu)質(zhì)種苗，生產(chǎn)效率高。
[0022]3、原球莖增殖時(shí)，添加低濃度矮壯素(濃度為0.01-0.5mg/L)，促進(jìn)原球莖的增殖和分化，而且芽苗健壯；批量化生產(chǎn)時(shí)，再添加較高濃度矮壯素進(jìn)行培養(yǎng)，能獲得高質(zhì)量的種苗。本發(fā)明在生產(chǎn)過(guò)程中，根據(jù)苗的長(zhǎng)勢(shì)，控制好矮壯素的適宜濃度，能獲得最佳培養(yǎng)效果O
[0023]4、以生產(chǎn)10000L鐵皮石斛培養(yǎng)基為例，如每升添加10g香蕉，需添加1000kg香蕉，單價(jià)為7.0元/kg，增加了 7000元的成本；如每升添加Ig脯氨酸，需1kg脯氨酸，單價(jià)
1.8元/g，增加了 18000元的成本；每升添加100毫升椰子汁，需1000000ml椰子汁，單價(jià)為0.015元/ml，增加了 15000元的成本。本發(fā)明選擇常用MS為基本培養(yǎng)基，矮壯素為壯苗劑，無(wú)需添加香蕉汁、馬鈴薯汁、脯氨酸、水解酪蛋白、茶多酚、活性炭等其它特殊成分；本發(fā)明方法配置10000L培養(yǎng)基，只需5-10克矮壯素，單價(jià)為0.9元/g，僅需4.5-9.0元，可忽略不計(jì)。本發(fā)明不僅減少了無(wú)菌操作步驟，而且節(jié)約了培養(yǎng)室空間，簡(jiǎn)化了健康種苗生產(chǎn)程序，大幅度降低了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率。
【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1為鐵皮石斛原球莖增殖分化生長(zhǎng)情況；
[0025]圖2為鐵皮石斛分散的原球莖；
[0026]圖3為鐵皮石斛原球莖轉(zhuǎn)瓶后的情況；
[0027]圖4為鐵皮石斛繼代培養(yǎng)原球莖同步增殖分化壯苗和生根情況；
[0028]圖5增殖分化壯苗生根苗；
[0029]圖6為移栽成活的鐵皮石斛試管苗生長(zhǎng)情況；
[0030]圖7為鐵皮石斛大規(guī)模瓶苗生產(chǎn)；
[0031 ]圖8為鐵皮石斛大規(guī)模盆苗生產(chǎn)；
[0032]圖9為鐵皮石斛大規(guī)模成苗生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0033]以下結(jié)合實(shí)施例旨在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0034]實(shí)施例1、組織培養(yǎng)快