一種白及種苗高效組培快繁技術(shù)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于利用組織培養(yǎng)進(jìn)行藥用植物育苗的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種白及種苗高效組培快繁技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]m Bletilla為蘭科白及屬多年生草本植物，是一種常用藥材，以塊莖入藥，具有收斂止血、消腫生肌之功效，用于治療咯血，吐血，外傷出血，瘡瘍腫毒，皮膚皸裂等癥。
[0003]由于白及市場主要依靠野生資源，盲目的私采濫挖，導(dǎo)致白及野生資源日漸枯竭。白及種子極小，而且沒有胚乳，自然萌發(fā)率極低，目前常用的分株繁殖，繁殖系數(shù)低，無法滿足規(guī)?；a(chǎn)的需求。因此，能否快速獲得白及種苗成為白及規(guī)?；N植的制約因素。為解決這個問題，采取組織培養(yǎng)技術(shù)獲得白及組培苗逐步成為白及種苗獲得的重要措施，并且已經(jīng)取得了較大進(jìn)展，出現(xiàn)了許多白及種苗方面的育種技術(shù)，采用不同方法獲得白及種苗，但對于后期組培苗的煉苗、馴化環(huán)節(jié)的技術(shù)不明確，效果也不夠好。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對當(dāng)前白及人工栽培中種子萌發(fā)率低，自然繁殖差的問題，提供一種白及種苗組培快繁技術(shù)，不僅可以高效的獲得白及組培苗，還對白及組培苗的煉苗、馴化機(jī)制進(jìn)行了研究，利用組織培養(yǎng)技術(shù)，可以獲得大量的白及種苗，為白及規(guī)?；N植奠定了基礎(chǔ)。
[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種白及種苗高效組培快繁技術(shù)，將無菌白及蒴果中的白及種子撒播在種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，進(jìn)行種子無菌萌發(fā)，然后將萌發(fā)后所獲得小苗分株接種在增殖繼代培養(yǎng)基中，進(jìn)行增殖繼代培養(yǎng)，得到白及叢生苗后將其接種在生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根培養(yǎng)，再將得到的白及組培苗種植于所制備的煉苗基質(zhì)中進(jìn)行煉苗，煉苗后移栽大田種植即可，其中，獲得無菌白及蒴果的方法為:選取成熟但尚未開裂的白及蒴果，先用流水沖洗表面雜質(zhì)并瀝干，然后用75%的酒精棉球把蒴果表面擦拭干凈，再將其轉(zhuǎn)移至超凈工作臺內(nèi)，用75%的酒精溶液浸泡30秒后，依次用0.1-0.5%的升汞溶液消毒6min以及無菌水沖洗2-3次，再用無菌濾紙吸干表面的水分后，得到無菌的白及蒴果，所述的種子無菌萌發(fā)以及煉苗的方法如下:
(O種子無菌萌發(fā)的方法為:將撒播有白及種子的種子萌發(fā)培養(yǎng)基置于培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25°C，當(dāng)培養(yǎng)基上的種子開始萌綠時，將其轉(zhuǎn)為光培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2000-25001x，光照為每天12小時，并連續(xù)照射，光培養(yǎng)15~20天后分化為叢生芽的小苗，完成無菌萌發(fā)；
其中，所述種子萌發(fā)培養(yǎng)基的組成為:MS、蔗糖、瓊脂以及馬鈴薯，其中蔗糖的添加量為30g/L，瓊脂的添加量為8g/L，馬鈴薯的添加形式為糊狀，其添加量為10-12g/L，種子萌發(fā)培養(yǎng)基的PH為5.5-6.0 ; (2)煉苗的方法為:取盛有經(jīng)生根培養(yǎng)所得的白及組培苗的組織培養(yǎng)瓶，打開瓶蓋，向其中噴灑5~8ml的無菌水后，在培養(yǎng)室內(nèi)放置2~3天，然后將組織培養(yǎng)瓶移出培養(yǎng)室放置在室外2~3天，在室外培養(yǎng)期間，溫度保持在20~25°C，濕度保持在30~40%，然后取出組織培養(yǎng)瓶內(nèi)的白及組培苗，用蒸餾水清洗掉組培苗根部的培養(yǎng)基后，在0.2mg/L的NAA中浸泡30秒，種植于煉苗基質(zhì)中，煉苗90天后即可移栽大田種植；
其中，所述的煉苗基質(zhì)的成分包括中位泥炭土、珍珠巖以及碎木肩，碎木肩為鋸末，其制作方法為:先將中位泥炭土經(jīng)高溫濕熱滅菌，滅菌溫度121°C，滅菌時間為20min，然后將中位泥炭土、珍珠巖以及碎木肩按照體積比5:2:3的比例混合后，加入滅菌的蒸餾水拌勻，使其含水量為50~55%即可，然后將所制作的煉苗基質(zhì)放置于育苗盤中，并放在遮陽率為50%的拱棚中備用，拱棚中的濕度為50~55%，溫度為15~25°C。
[0006]進(jìn)一步的，所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基的制備方法為:先將馬鈴薯清洗掉表面雜質(zhì)，然后去皮放入蒸餾水中加熱，沸騰后繼續(xù)煮沸30min，然后將馬鈴薯取出搗碎成馬鈴薯泥，并將煮沸后的蒸餾水冷卻至室溫加入馬鈴薯泥中混勻成糊狀，最后將糊狀的馬鈴薯與蔗糖、瓊脂按照所述的添加量依次加入MS中，并攪拌均勻即可。
[0007]進(jìn)一步的，在增殖繼代培養(yǎng)中，其培養(yǎng)方法為:在超凈工作臺內(nèi)，將種子無菌萌發(fā)所獲得的叢生芽小苗分株后接種在盛有增殖繼代培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶接種20-25株，并將接種后的組織培養(yǎng)瓶至于培養(yǎng)室內(nèi)光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25°C，光照強(qiáng)度為2000-25001x，培養(yǎng)期間每天的光照時間為12h，50天后獲得3~5cm的白及叢生苗；
所述的增殖繼代培養(yǎng)基的配方配比為:MS+ KT 1.0 mg/ L +NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂9 g/Lo
[0008]進(jìn)一步的，在生根培養(yǎng)的過程中，其培養(yǎng)方法如下:在超凈工作臺內(nèi)將增殖繼代培養(yǎng)所獲得的叢生苗分成單株，接種在盛有生根培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶接種20~25株，置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，，培養(yǎng)溫度為25°C，光照強(qiáng)度為2000-25001x，光照為每天12小時，40天后可獲得株高5-8cm，根長2-3cm的白及組培苗，生根率達(dá)95%以上；
所述的生根培養(yǎng)基的配方配比為:MS+NAA 0.2mg/L+ IAAl.0mg/L+蔗糖30g/L +瓊脂9g/L+25-30g/L 馬鈴薯。
[0009]進(jìn)一步的，在所述的煉苗基質(zhì)中加入0.lg/L的多菌靈溶液。
[0010]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
第一，本發(fā)明技術(shù)成熟，體系完善，可有效解決白及自然萌發(fā)率低，種苗獲得困難的現(xiàn)狀，具有較好的推廣、應(yīng)用價(jià)值，市場前景廣闊；
第二，本發(fā)明所提供的方法中，種子無菌萌發(fā)階段所用的種子萌發(fā)培養(yǎng)基中并未添加任何激素，而是利用經(jīng)過處理的馬鈴薯中的天然物質(zhì)為白及種子萌發(fā)提供養(yǎng)分，再加之采用暗培養(yǎng)和光培養(yǎng)相結(jié)合的培養(yǎng)方法，即可在30天內(nèi)使白及種子萌發(fā)獲得叢生芽，相對于外源添加激素，既降低了培養(yǎng)成本，又減少了培養(yǎng)過程對激素的利用，更符合綠色農(nóng)業(yè)的理念，并且，經(jīng)計(jì)算，白及種子的萌發(fā)率達(dá)到98%以上；
第三，本發(fā)明在煉苗階段所提供的煉苗培養(yǎng)基組成成分容易獲取，配比合理，保證白及組培苗煉苗、馴化過程中的保水、透氣和營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，顯著提高白及組培苗煉苗、馴化的成活率。
【附圖說明】
[0011]圖1是種子無菌萌發(fā)階段采用不同種子萌發(fā)培養(yǎng)基對種子萌發(fā)率的影響。
[0012]圖2是生根培養(yǎng)階段采用不同生根培養(yǎng)基對生根率的影響。
[0013]圖3是采用不同煉苗基質(zhì)對成活率的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面通過【具體實(shí)施方式】以及試驗(yàn)例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0015]實(shí)施例1:一種白及種苗高效組培快繁技術(shù)，其步驟包括材料準(zhǔn)備、種子無菌萌發(fā)、增殖繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)以及煉苗與馴化，具體方法如下:
1.材料準(zhǔn)備
選取成熟但尚未開裂的白及蒴果，先用流水沖洗表面雜質(zhì)并瀝干，然后用75%的酒精棉球把蒴果表面擦拭干凈，再將其轉(zhuǎn)移至超凈工作臺內(nèi)，用75%的酒精溶液浸泡30秒后，依次用0.1%的升汞溶液消毒6min以及無菌水沖洗2_3次，再用無菌濾紙吸干表面的水分后，得到無菌的白及蒴果。
[0016]2、種子無菌萌發(fā)
2.1、種子萌發(fā)培養(yǎng)基的準(zhǔn)備
在MS培養(yǎng)基中依次加入30g/L的蔗糖、8g/L的瓊脂以及10g/L的糊狀馬鈴薯，攪拌混勻，并調(diào)整pH至5.5，并置于培養(yǎng)瓶中備用，其中，糊狀馬鈴薯的制備方法為:將馬鈴薯清洗掉表面雜質(zhì)，然后去皮放入蒸餾水中加熱，沸騰后繼續(xù)煮沸30min，然后將馬鈴薯取出搗碎成馬鈴薯泥，并將煮沸后的蒸餾水