毛竹原生質(zhì)體培養(yǎng)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及林木生物技術(shù)和細(xì)胞工程育種領(lǐng)域，特別涉及到毛竹原生質(zhì)體培養(yǎng)。
【背景技術(shù)】
[0002]作為植物細(xì)胞工程的重要組成部分，原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)興起于上世紀(jì)六七十年代，幾十年來被廣泛應(yīng)用于植物的遺傳和育種學(xué)研究領(lǐng)域。隨著基因工程的發(fā)展，原生質(zhì)體系統(tǒng)同時也成為基因表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位的重要工具，在生物技術(shù)領(lǐng)域發(fā)揮著重要的功能。
[0003]1960年，Cocking采用酶法分離原生質(zhì)體獲得成功，提供了一種大量制備有活力的原生質(zhì)體的方法，開創(chuàng)了植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和細(xì)胞雜交的研究領(lǐng)域(參考文獻(xiàn)I)。
[0004]1971年，Nagata和Takebe從培養(yǎng)的煙草葉肉原生質(zhì)體獲得完整的再生細(xì)胞，極大地推動了這方面的研究(參考文獻(xiàn)2)；
[0005]1972年，Carlson用NaNO3做融合劑將兩種煙草的原生質(zhì)體融合，培養(yǎng)出世界上第一株體細(xì)胞雜種(參考文獻(xiàn)3)；
[0006]原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)的突破，促使人們期望通過體細(xì)胞雜交來轉(zhuǎn)移目標(biāo)性狀進(jìn)而實現(xiàn)植物的遺傳改良，成為遺傳育種學(xué)研究的新手段，隨著培養(yǎng)技術(shù)的不斷進(jìn)步，原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)相繼在禾本科植物上取得成功，成為禾本科作物育種的重要途徑。
[0007]1995年，Spangenberg等通過原生質(zhì)體培養(yǎng)實現(xiàn)了多花黑麥草與高羊茅的體細(xì)胞雜交，將后者的CMS轉(zhuǎn)移到前者(參考文獻(xiàn)4);
[0008]1998年，Kisaka et al.獲得水稻與大麥的族間體細(xì)胞雜種的再生植株并結(jié)實(參考文獻(xiàn)5)；
[0009]2003年，Xia et al.利用小麥與高冰草獲得可育雜種植株，并將高冰草的優(yōu)質(zhì)、耐鹽等目標(biāo)性狀轉(zhuǎn)入小麥(參考文獻(xiàn)6)。這些研究工作極大地鼓舞了其他植物的原生質(zhì)體培養(yǎng)熱情，推動著這一繁瑣而又復(fù)雜的培養(yǎng)體系不斷地發(fā)展進(jìn)步。
[0010]關(guān)于竹類植物原生質(zhì)體培養(yǎng)的研究，報道甚少。1990年Huang et al.利用蓬萊竹Bambusa multiplex和綠竹Bambusa oIdhamii的愈傷組織，在I %的纖維素酶(Cellulysin)、2 % 的崩潰酶(Driselase)和 I % 的果膠酶(Pectolysase)上，于 12°C、80rmp酶解16h，獲得原生質(zhì)體；然后在附加BSA、arpinine HCUMES以及0.6M mannitol的培養(yǎng)基上，蓬萊竹原生質(zhì)體成活率達(dá)60%，綠竹達(dá)40%，但未見植株再生(參考文獻(xiàn)7)。
[0011]1994年闕國寧等以Dendrocalamus membranceus莖段為材料誘導(dǎo)出愈傷組織，然后在添加4%纖維素酶(Cellulase) R_10、2 %離析酶(Macerozyme)和0.25%果膠酶(Pectinase)的培養(yǎng)基上，在40_50rpm、28°C的黑暗條件下酶解6h，過濾、離心及純化后獲得了活力80%以上的原生質(zhì)體，其產(chǎn)量達(dá)到了每克鮮重2.5 X 15個原生質(zhì)體，但未見原生質(zhì)體繼代培養(yǎng)及植株再生(參考文獻(xiàn)8)。
[0012]竹類植物原生質(zhì)體培養(yǎng)的滯后，主要歸咎于其再生體系的不夠完善。竹是無形成層的特殊木本植物，其再生技術(shù)不同于普通的木本植物和草本植物，離體再生難度大，盡管國內(nèi)外已有較多竹子愈傷組織再生的報道，但是多數(shù)研究存在重復(fù)性差、再生效率低等缺點，特別是制備再生原生質(zhì)體的最佳材料-胚狀體系統(tǒng)匱乏，阻礙了其原生質(zhì)體培養(yǎng)的研究。雖然同為禾本科植物，但是竹子不如農(nóng)業(yè)作物的經(jīng)濟(jì)價值高，因此相應(yīng)的研究投入和重視度都不夠，最終形成了竹類植物幾無原生質(zhì)體成功再生的現(xiàn)狀。
[0013]鑒于竹類植物由于開花結(jié)實習(xí)性特殊導(dǎo)致的種質(zhì)創(chuàng)新困難、育種技術(shù)匱乏等問題，本發(fā)明提供了毛竹原生質(zhì)體培養(yǎng)的方法，從而為毛竹的細(xì)胞工程、基因工程以及分子生物學(xué)的研究提供技術(shù)平臺，具有一定的理論研究價值，也能推動竹子的種質(zhì)資源創(chuàng)新工作，具有重要的生產(chǎn)實踐意義。
[0014]主要參考文獻(xiàn)
[0015]1.Cocking EC(1960)A method for the isolat1n of plant protoplasts andvacuoles.1960，Nature 187，962-963 ;do1:10.1038/187962a0
[0016]2.Nagata T，Takebe I (1970)Cell wall regenerat1n and cell divis1n inisolated tobacco mesophyll protoplasts.Planta，92(4):301-308
[0017]3.Carlson PS，Smith HH(1972)Dearing RD.Parasexual interspecific planthybridizat1n.Proceedings of the Nat1nal Academy of Sciences，69 (8):2292-2294
[0018]4.Spangenberg G，Wang Z Y，Wu X L，et al.(1995) Transgenic tallfescue (Festuca arundinacea)and red rescue (F.rubra)plants from microprojectilebombardment of embryogenic suspens1n cells.Journal of Plant Phys1logy，145(5):693-701.
[0019]5.Kisaka H，Kisaka M，Kanno A，et al.(1998)Intergeneric somatichybridizat1n of rice(Oryza sativa L.) and barley(Hordeum vulgare L.) byprotoplast fus1n.Plant cell reports，17 (5):362-367.
[0020]6.Xia GM(2009)Progress of chromosome engineering mediated by asymmetricsomatic hybridizat1n.Journal of Genetic Genomics 36:547-556
[0021]7.Huang L C，Huang B L，Chen ff L.(1990)Tissue culture investigat1ns ofbambo0.V.Recovery of callus from protoplasts of suspens1n-cultured Bambusacells.Bot Bull Acad Sin，31:29-34.
[0022]8.闕國寧，諸葛強(qiáng)(1994)黃竹細(xì)胞懸浮培養(yǎng)和原生質(zhì)體分離.林業(yè)科學(xué)研究，7(1):44-47
[0023]本發(fā)明的特點
[0024]縱觀國內(nèi)外對竹類植物原生質(zhì)體培養(yǎng)的研究現(xiàn)狀可知，當(dāng)前僅有個別竹種被嘗試應(yīng)用于開展原生質(zhì)體的培養(yǎng)，且研究局限于原生質(zhì)體的分離階段，尚未有實現(xiàn)植株再生的報道。作為我國和世界上最常見、最重要的竹種之一，目前尚未見關(guān)于毛竹原生質(zhì)體培養(yǎng)的報道。對于開花結(jié)實習(xí)性特殊的竹類植物而言，原生質(zhì)體培養(yǎng)體系的構(gòu)建可以避開開花結(jié)實等常規(guī)育種途徑的限制，通過細(xì)胞途徑實現(xiàn)種質(zhì)創(chuàng)新，顯著推動其遺傳學(xué)和育種學(xué)領(lǐng)域的深入研究，具有重要的理論和實踐價值。經(jīng)過開展大量研究和實驗，并對同類研究進(jìn)行了重要改進(jìn)，發(fā)明人掌握了毛竹原生質(zhì)體培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)，在國際上首次公開毛竹原生質(zhì)體培養(yǎng)的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0025]毛竹Phyllostachys edulis原生質(zhì)體培養(yǎng)的方法，其特征包括:胚性愈傷組織的酶解，原生質(zhì)體的分離與純化，原生質(zhì)體的培養(yǎng)，愈傷組織的分化，以及壯苗、煉苗和移栽過程，具體步驟如下:
[0026](I)胚性愈傷組織的酶解:選擇致密淡黃色的毛竹胚性愈傷組織若干，將其放置在愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，26°C暗培養(yǎng)7-15d，邊緣生長出白色較疏松的胚性愈傷組織，愈傷組織增殖培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加l-3mg/L的2，4-D、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白、30g/L的葡萄糖、8g/L的瓊脂粉；然后將剛長出的白色較疏松的胚性愈傷組織分離，放入裝有酶解液的培養(yǎng)皿中，并將培養(yǎng)皿置于70rpm的搖床上進(jìn)行避光酶解3_5h，酶解液由2 %的cellulase、1.5 %的macerozyme、0.I %的MES、0.7M 的 manitol、0.1% 的 CaCl2.2H20、I % 的 BSA 組成，pH = 5.80 ；