Rag2基因敲除大鼠在建立個性化腫瘤治療模型中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及RAG2基因敲除大鼠在建立個性化腫瘤治療模型中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤是對人類威脅最大的疾病之一，相對于其它疾病，腫瘤臨床治療的有效率目 前仍然偏低。隨著人類基因組學(xué)、藥物基因組學(xué)及腫瘤分子生物學(xué)研究的不斷深入，研究者 對腫瘤多成因、異質(zhì)性的特點有了更加全面的認(rèn)識。基因組測序研究發(fā)現(xiàn)，相同病理類型的 腫瘤之間基因突變重復(fù)很少；相同類型腫瘤的不同個體之間的基因突變譜差異很大，運是 造成相同病理類型腫瘤具有不同臨床表型的生物學(xué)基礎(chǔ)，也是同類型腫瘤的不同個體對相 同治療反應(yīng)很不一樣的原因，因此個體化治療已經(jīng)成為腫瘤臨床治療的發(fā)展方向和最有效 的手段。個體化治療致力于尋找可預(yù)測特異性治療應(yīng)答的疾病特征W改善個體化治療效 果，因此建立個性化的腫瘤治療模型是一種簡便而直接的手段。
[0003] 腫瘤動物模型的建立是研究致瘤機制、抗腫瘤藥物檢測和腫瘤分子生物學(xué)極其重 要的手段。由于倫理限制、成本高、操作不便等原因，利用與人類接近的靈長類動物進(jìn)行的 試驗是有限的，而且臨床上的觀察和研究也較為淺顯。大鼠由于容易飼養(yǎng)、方便操作、成本 低等優(yōu)點，是目前生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)和應(yīng)用的主要模型之一。人源化大鼠模型是指帶有功能性 的人類基因、細(xì)胞或組織的大鼠模型，運種模型通常被用做人類疾病體內(nèi)研究的活體替代 模型，能夠建立可用于移植人類造血組織和人體免疫的動物品系。近年來人源化大鼠模型 已被證明在解碼人類疾病奧秘中具有巨大的優(yōu)勢和廣泛的應(yīng)用前景，成為人類疾病研究和 臨床前應(yīng)用研究的重要工具之一。利用大鼠建立各種個性化腫瘤治療模型，用W具體研究 每個患者自身的情況，W便評價具有抗腫瘤功效的藥物和制定有效的治療方法，是研究發(fā) 展的趨勢。
[0004] 重組激活基因（recombination-activatinggene,RAG)編碼重組激活蛋白，其中 兩個重組激活基因RAG1和RAG2所編碼的RAG1蛋白和RAG2蛋白構(gòu)成的復(fù)合體蛋白酶參與 了V(Vari油le)基因片段、D值iversity)基因片段和JCJoining)基因片段的基因重組[即 V值)J重排]過程并起著關(guān)鍵的作用?；虻闹嘏攀橇芗杭?xì)胞表面標(biāo)志發(fā)生過程中的一個 重要過程，對于細(xì)胞成熟后的功能和結(jié)構(gòu)有著重要的作用，因此RAG2基因?qū)τ诹芗杭?xì)胞分 化發(fā)育十分關(guān)鍵。大鼠重組激活基因2(recombination-activatinggene2,RAG2)位于大 鼠的2號染色體，由3個外顯子組成，編碼序列位于外顯子3中。當(dāng)RAG2基因被敲除后，大 鼠體內(nèi)的V值)J重排喪失，T和B淋己細(xì)胞分化、發(fā)育被完全阻斷，導(dǎo)致重度聯(lián)合免疫缺陷 病。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何建立個性化腫瘤治療模型，進(jìn)行個性化腫瘤治 療。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了RAG2基因敲除大鼠在構(gòu)建腫瘤治療模 型中的應(yīng)用。
[0007] 上述應(yīng)用中，所述RAG2基因敲除大鼠無腫瘤。
[0008] 上述應(yīng)用中，所述腫瘤來源于人。
[0009] 上述應(yīng)用中，所述腫瘤可為實體瘤或非實體瘤。
[0010] 上述應(yīng)用中，所述腫瘤可為惡性腫瘤，所述惡性腫瘤可為肝癌、甲狀腺癌、直腸癌 和胃癌中任一種。
[0011] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了構(gòu)建腫瘤治療模型的方法。
[0012] 本發(fā)明所提供的構(gòu)建腫瘤治療模型的方法，包括將腫瘤接種于RAG2基因敲除大 鼠，獲得接種了腫瘤的RAG2基因敲除大鼠，飼養(yǎng)所述接種了腫瘤的RAG2基因敲除大鼠，獲 得具有所述腫瘤的RAG2基因敲除大鼠，所述具有腫瘤的RAG2基因敲除大鼠為腫瘤治療模 型。
[0013] 上述方法中，所述RAG2基因敲除大鼠無腫瘤。
[0014] 上述方法中，所述腫瘤可接種于所述RAG2基因敲除大鼠的前肢蔽窩皮下或背部。
[0015] 上述方法中，所述腫瘤來源于人。
[0016] 上述方法中，所述腫瘤可為組織和/或細(xì)胞，具體可為組織，進(jìn)一步的，所述組織 為實體瘤，所述接種的實體瘤塊的體積可為0. 125mm3-0. 5mm3,具體可為0. 18mm3。
[0017] 上述方法中，所述腫瘤可為惡性腫瘤，所述惡性腫瘤可為肝癌、甲狀腺癌、直腸癌 和胃癌中任一種。
[0018] 上述方法中，飼養(yǎng)所述接種了腫瘤的RAG2基因敲除大鼠的時間為30d-90d，具 體地，當(dāng)所述腫瘤為肝癌時，飼養(yǎng)所述接種了腫瘤的RAG2基因敲除大鼠的時間具體可為 32d;當(dāng)所述腫瘤為甲狀腺癌時，飼養(yǎng)所述接種了腫瘤的RAG2基因敲除大鼠的時間具體可 為60d;當(dāng)所述腫瘤為直腸癌時，飼養(yǎng)所述接種了腫瘤的RAG2基因敲除大鼠的時間具體可 為49d;當(dāng)所述腫瘤為胃癌時，飼養(yǎng)所述接種了腫瘤的RAG2基因敲除大鼠的時間具體可為 45d。
[0019] 上文中，RAG2基因敲除大鼠是將SD大鼠的RAG2基因敲除得到的大鼠。所述RAG2 基因敲除大鼠中沒有成熟的T淋己細(xì)胞和B淋己細(xì)胞。所述RAG2基因敲除大鼠的基因型 為RAG2/。
[0020] 實驗證明，利用RAG2基因敲除大鼠為載體，移植患者自身的腫瘤組織，成功建立 了具有個性化的人源化RAG2基因敲除大鼠腫瘤治療模型。與已有的免疫缺陷的小鼠移植 腫瘤模型相比，該治療模型建立了不同通路異常的腫瘤模型，忠實地模擬了患者自身腫瘤 疾病的情況，可通過每個患者的特點來評價抗腫瘤功效的藥物和治療方法。利用RAG2基因 敲除大鼠建立個性化腫瘤治療模型的方法工序簡單，周期短，成瘤率高，費用低的優(yōu)點，對 于不同種類的腫瘤組織均可W成瘤，接種了肝癌腫瘤瘤塊的RAG2基因敲除大鼠的成瘤率 為100%，接種了甲狀腺癌和直腸癌腫瘤瘤塊的RAG2基因敲除大鼠的成瘤率均為66. 7%， 接種了胃癌腫瘤瘤塊的RAG2基因敲除大鼠的成瘤率為33. 3%。接種肝癌腫瘤瘤塊的RAG2 基因敲除大鼠的腫瘤出現(xiàn)的時間是32山接種甲狀腺癌腫瘤瘤塊的RAG2基因敲除大鼠的腫 瘤出現(xiàn)的時間是60山接種直腸癌腫瘤瘤塊的RAG2基因敲除大鼠的腫瘤出現(xiàn)的時間是49山 接種胃癌腫瘤瘤塊的RAG2基因敲除大鼠的腫瘤出現(xiàn)的時間是45山因此可W廣泛被應(yīng)用于 腫瘤的個性化治療中。
【附圖說明】
[OOW 圖1為四種RAG2基因敲除大鼠的測序結(jié)果。其中，rag2-WT代表野生型SD大鼠， 紅框部分代表EarI酶的識別位點；#4-缺1個堿基代表4號RAG2基因敲除大鼠；#13-缺 2個堿基代表13號RAG2基因敲除大鼠；#15-缺5個堿基代表15號RAG2基因敲除大鼠； #33-缺7個堿基代表33號RAG2基因敲除大鼠。
[0022] 圖2為RAG2基因敲除大鼠的RAG2基因的酶切鑒定結(jié)果。其中，泳道M為DNA分 子量Marker,泳道1為RAG2+/大鼠（基因型為RAG2 +/)基因組DNA的酶切產(chǎn)物，泳道2為 野生型SD大鼠基因組DNA的酶切產(chǎn)物，泳道3和4均為RAG2/大鼠（基因型為RAG2 / )基 因組DNA的酶切產(chǎn)物，泳道5為陰性對照。 陽02引圖3為RAG2基因敲除大鼠的RAG2基因的表達(dá)水平的實時巧光定量PCR分析結(jié)果。 其中，WT代表野生型SD大鼠，K0代表RAG2 /大鼠（基因型為RAG2 /)。
[0024]圖4為RAG2基因敲除大鼠中的T淋己細(xì)胞、B淋己細(xì)胞、NK細(xì)胞和粒細(xì)胞的相對 計數(shù)。其中，WT代表野生型SD大鼠，K0代表RAG2 /大鼠（基因型為RAG2 /)。
【具體實施方式】
[00巧]下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[00%] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0027] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0028] 下述實施例中的SD大鼠（野生型SD大鼠）為北京華阜康生物科技股份有限公司 的產(chǎn)品。
[0029] 下述實施例中的AmbionmMESSAGE地継細(xì)IRI隣SP6TranscriptionKit為英濰 捷基（上海）貿(mào)易有限公司的產(chǎn)品。
[0030] 下述實施例中的腫瘤組織來源于人的肝癌、甲狀腺癌、直腸癌和胃癌。
[0031] RAG2基因敲除大鼠在隔離環(huán)境條件下飼養(yǎng)，該環(huán)境設(shè)施采用無菌隔離裝置W保存 無菌或無外來污染動物。隔離裝置內(nèi)的空氣、飼料、水、墊料和設(shè)備均為無菌，動物和物料的 動態(tài)傳遞須經(jīng)特殊的傳遞系統(tǒng)，該系統(tǒng)既能保證與環(huán)境的絕對隔離，又能滿足轉(zhuǎn)運動物時 保持內(nèi)環(huán)境一致。
[0032] 下述實施例中所用試劑的配制： 陽的3]憐酸鹽緩沖液：7. 9g 化C1，0. 2g KC1，0. 24g 皿2?〇4(或 1. 44g 胞2冊〇4)，1. 8g K2HPO4,加蒸饋水定容至1L，抑值為7. 4,120°C高壓蒸汽滅菌20min后室溫（20-30°C)保 存。
[0034] 實施例1、利用RAG2基因敲除大鼠建立個性化腫瘤治療模型
[0035] 一、RAG2基因敲除大鼠的獲得 W36] 大鼠RAG2基因位于大鼠的2號染色體，由3個外顯子組成，編碼序列位于 外顯子3中。RAG2基因敲除大鼠是利用TALEN技術(shù)創(chuàng)建，針對大鼠RAG2基因（Gene 10:295953,ht1:p://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/295953)設(shè)計的TALEN勒1 點序列如 下CTAAAGATTCCTGCTACctcccacctcttcgttacCCAGCTACTTGCTCGT，其中左邊TALE識別序 列如下：CTAAAGATTCCTGCTAC;右邊TALE識別序列如下：ACGAGCAAGTAGCTGG;中間為間 隔序列。針對左邊TALE識別序列的重復(fù)可變的雙連氨基酸殘基位點巧巧eatVariant Di-residue，RVD)的序列如下：皿NGNININI順NINGNG皿皿NG順皿NGNI皿。 針對右邊TALE識別序列的RVD序列如下：NI皿順NI順皿NINI順NGNI順皿NG 順順。TALEN質(zhì)粒組裝使用化len(增強型）打祀質(zhì)粒構(gòu)建試劑盒（北京唯尚立德生物 科技有限公司，產(chǎn)品目錄號VK006-05)進(jìn)行，具體操作參見說明書化ttp://www.v-solid. (3〇111/1:八-3〇11(1/11；17";1^;[163/口壯/1曰16合成試劑盒說明書-2014.5.29.口壯)，獲得組裝的兩 個TALEN表達(dá)質(zhì)粒。通過AmbionmMESSAGEmMACHINE?SP6TranscriptionKit將兩個 組裝的TALEN表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)錄合成兩條mRNA，將合成的兩條mRNA通過顯微操作注射到 SD大鼠的受精卵（受精卵為SD大鼠的卵細(xì)胞與SD大鼠的精子通過受精獲得的），獲得含 有合成的兩條mRNA的受精卵。將含有合成的兩條mRNA的受精卵移植到假孕SD大鼠受體 母鼠體內(nèi)，待移植了含有