一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液及凍存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明設(shè)及干細(xì)胞領(lǐng)域，具體設(shè)及一種廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液及凍存方 法。
【背景技術(shù)】 陽(yáng)00引干細(xì)胞（stemcell)是一類具有自我復(fù)制能力（self-renewing)的多潛能細(xì)胞。 在一定條件下，它可W分化成多種功能細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymalstemcells, MSC)是干細(xì)胞家族的重要成員，來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層。MSC具有自我復(fù)制、 自我更新、多方向分化潛能、造血支持W及免疫調(diào)控等特性。在特定的機(jī)體外分化環(huán)境下， 能夠誘導(dǎo)分化為神經(jīng)、屯、臟、骨、軟骨、脂肪、上皮等多種組織細(xì)胞，被認(rèn)為是細(xì)胞治療技術(shù) 的最有希望的來(lái)源細(xì)胞之一。除此W外，間充質(zhì)干細(xì)胞能分泌多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括血管內(nèi) 皮生長(zhǎng)因子（vEGF)、胎盤生長(zhǎng)因子（PGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGFs)、血小板源生長(zhǎng)因子 (PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-P)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HG巧等在內(nèi)的各種生長(zhǎng)因子，運(yùn)些生長(zhǎng) 因子可參與多種細(xì)胞反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，而收集條件培養(yǎng)基是獲得運(yùn)些活性成分的有效 方法。
[0003] 而來(lái)源于人廝帶的間充質(zhì)干細(xì)胞，取材方便，來(lái)源豐富，易于采集和運(yùn)輸，生物學(xué) 特性穩(wěn)定，免疫原性低，無(wú)異體排斥反應(yīng)，成本低，對(duì)捐獻(xiàn)者無(wú)損害及不設(shè)及倫理問題等優(yōu) 勢(shì)，使其成為未來(lái)干細(xì)胞在醫(yī)療應(yīng)用上具有巨大潛力的理想選擇。
[0004] 間充質(zhì)干細(xì)胞在體外經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng)和凍存復(fù)蘇后仍具有多向分化潛能，可作 為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)。因此，研究一種有效的廝帶 間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存方法，使具有臨床應(yīng)用價(jià)值的廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞能在體外長(zhǎng)期保存并 維持原有的多向分化能力，顯得尤為重要。
[0005] 廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存需要將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞收集起來(lái)，加入含有特定 成分的細(xì)胞凍存保護(hù)液制成單細(xì)胞懸液，分裝于凍存管中置于超低溫冰箱或者液氮中進(jìn)行 長(zhǎng)期凍存。
[0006] 目前現(xiàn)有技術(shù)中，廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞凍存保護(hù)液配方一種是WDMS0和血 清為主要成分，另一種是W培養(yǎng)基、DMS0和血清為主要成分。此外還有一些配方是在上述 兩種配方的基礎(chǔ)上添加其他保護(hù)細(xì)胞的物質(zhì)。但上述配方凍存廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞均效果不 理想，復(fù)蘇后細(xì)胞回收率及細(xì)胞活率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 有鑒于此，本發(fā)明目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種廝帶間充質(zhì)干細(xì) 胞的凍存保護(hù)液及凍存方法。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0009] 一種廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液，包括
[0010] DMS0 lOv/v% -20v/v%
[0011] 廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基 30v/v%-80v/v%
[0012] 胎牛血清 lOv/v%-50v/v%。
[0013]其中，所述廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液中所述廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基 的制備方法為：取P1-P5代的廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞酶解消化后傳代，連續(xù)培養(yǎng)24-7化后，收集 培養(yǎng)上清，離屯、后取上清。
[0014] 在一些實(shí)施方案中，所述廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的制備方法中所述P1-P5 代的廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞優(yōu)選為匯合度80-90 %廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0015] 在一些實(shí)施方案中，所述廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的制備方法中所述 酶解消化具體為向細(xì)胞中加入0. 015血/cm2-0. 04mL/cm2的0. 05 % -0. 3 %的膜酶和 0. 01 % -0. 04%邸TA消化lmin-3min，完全培養(yǎng)基終止酶解。
[0016] 在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述終止酶解的完全培養(yǎng)基的加入量為消化液體積的5 倍~10倍。
[0017]在一些實(shí)施方案中，所述廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的制備方法中所述傳代為 酶解消化后的細(xì)胞離屯、，完全培養(yǎng)基重選后，按80000個(gè)細(xì)胞/cm2-15000個(gè)細(xì)胞/cm2的傳 代密度傳代，細(xì)胞連續(xù)生長(zhǎng)24h-72h。
[0018] 其中，所述酶解消化后的離屯、優(yōu)選為200g-400g離屯、5min。
[0019] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可W理解，本發(fā)明所述完全培養(yǎng)基的組成為DMEM-F12 80v/ v%-95v/v%，F(xiàn)BS5v/v%-20v/v%。
[0020] 本發(fā)明所述廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的制備方法在廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞傳代 后收集培養(yǎng)上清，離屯、后取上清獲得廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基。其中，所述離屯、優(yōu)選為 200g-400g離屯、5min。
[0021] 本發(fā)明還提供了所述廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液的制備方法，按比例將廝帶 間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基與胎牛血清混合，然后加入DMS0,冰水浴中降溫至0°C。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存方法，將廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞消化離 屯、，加入廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度至0. 1X106個(gè)/mL-10X106個(gè)/mL，加 入等體積的所述廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液，混勻后，分裝至凍存管中，-80°C中凍存1 天-5天，轉(zhuǎn)移至液氮中長(zhǎng)久保存。 陽(yáng)02引其中，所述的凍存方法中，所述消化為向細(xì)胞中加入0. 015血/cm2-0. 04mL/cm2的 0. 05 % -0. 3 %的膜酶和0. 01 % -0. 04%邸TA消化lmin-3min，用5倍-10倍于消化液的完 全培養(yǎng)基終止酶解。
[0024] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明分別采用不同的凍存保護(hù)液凍存廝帶間充質(zhì)干細(xì) 胞，比較不同的凍存保護(hù)液凍存復(fù)蘇后細(xì)胞回收率、細(xì)胞活率W及細(xì)胞增殖情況，對(duì)比本發(fā) 明所述廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液與常規(guī)凍存液的凍存效果，結(jié)果顯示雖然細(xì)胞活率 沒有明顯差異，但經(jīng)本發(fā)明所述廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液凍存后復(fù)蘇的細(xì)胞回收率 明顯高于其他常規(guī)凍存液。而增殖情況結(jié)果顯示本發(fā)明所述廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù) 液凍存的細(xì)胞相對(duì)常規(guī)凍存液凍存的細(xì)胞，擴(kuò)增的倍數(shù)更多。
[0025] 由此可見，采用本發(fā)明所述廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液，結(jié)合本發(fā)明所述的 凍存方法進(jìn)行廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存，將起到更好的凍存效果。復(fù)蘇后的細(xì)胞不僅在回 收率上明顯高于其他常規(guī)凍存液，細(xì)胞增殖能力也優(yōu)于常規(guī)凍存液。
[00%] 本發(fā)明還提供了一種廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存試劑盒，包含本發(fā)明所述廝帶間充 質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液。
[0027] 本發(fā)明所述廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液包括lOv/v% -20v/v%DMS0、30v/ V% -80v/v%廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基、lOv/v% -50v/v%胎牛血清。與常規(guī)細(xì)胞凍存 液相比，采用本發(fā)明所述廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液凍存后復(fù)蘇，不僅在細(xì)胞回收率 上明顯高于其他常規(guī)凍存液，細(xì)胞增殖能力也優(yōu)于常規(guī)細(xì)胞凍存液，可W用于間充質(zhì)干細(xì) 胞的長(zhǎng)期保存及應(yīng)用。本發(fā)明所述廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存方法將廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞消化 離屯、后，加入廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度，加入等體積的本發(fā)明所述凍存 保護(hù)液后凍存細(xì)胞。與常規(guī)的凍存方法相比，本發(fā)明廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存方法凍存的 細(xì)胞復(fù)蘇后不僅在細(xì)胞回收率上明顯高于其他常規(guī)方法，細(xì)胞增殖能力也優(yōu)于常規(guī)的凍存 方法。
【附圖說(shuō)明】
[0028] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。
[0029] 圖1示實(shí)施例1復(fù)蘇后各組細(xì)胞增殖情況圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的 實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都 屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0031] 為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡述。 陽(yáng)0巧對(duì)比例1、
[0033] 分別采用表1中不同的凍存保護(hù)液凍存廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞，比較不同的凍存保護(hù) 液凍存復(fù)蘇后細(xì)胞回收率、細(xì)胞活率W及細(xì)胞增殖情況。
[0034] 表1不同的凍存保護(hù)液
[0035]
[0036]
[0037] 凍存方法如下：
[0038] 1、配制廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基：取匯合度80%的P2代的廝帶間充質(zhì)干細(xì) 胞，用PBS洗2遍后，往細(xì)胞中加入0. 015血/cm2的0. 25%的膜酶+0. 04%邸TA消化Imin， 用10倍于消化液的完全培養(yǎng)基終止酶解，200g離屯、5min，用完全培養(yǎng)基重選后，接種于培 養(yǎng)瓶中，傳代密度為10000個(gè)細(xì)胞每cm2。細(xì)胞連續(xù)生長(zhǎng)48h，收集培養(yǎng)上清，200g離屯、5min， 取上清，分裝后置于-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0039] 2、取匯合度80 %的P3代的廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞，用PBS洗2遍后，往細(xì)胞中加入 0. 015血/cm2的0. 25%的膜酶+0. 04%邸TA消化Imin，用10倍于消化液的完全培養(yǎng)基終 止酶解，取樣計(jì)數(shù)，平均分成S管，分別命名為A組、B組和C組。200g離屯、5min，去上清，A 組加入廝