骨髓間充質(zhì)干細胞保存液及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細胞保存液技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種骨髓間充質(zhì)干細胞保存液及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 干細胞治療是將具有不斷自我繁殖能力和多向化潛能的干細胞在體外培養(yǎng)后，再 將其移植入患者受損或缺損組織，從而實現(xiàn)對損傷組織的補充和修復(fù)。而目前能實現(xiàn)人骨 髓間充質(zhì)干細胞分離并大規(guī)模培養(yǎng)的細胞很少，在細胞培養(yǎng)完成之后，同時還需要對細胞 進行表型檢測、細胞形狀分析等等，之后將細胞保存在保存液中，待需要時再進行輸注。在 人骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)后進行保存的階段中，既要維持細胞的基本生命代謝以防止其死 亡，同時又要避免其代謝量過大而繼續(xù)大量增殖產(chǎn)生的大量形狀變異。所以細胞保存中，都 采用0.9WT%氯化鈉注射液、5WT%葡萄糖注射液、復(fù)方電解質(zhì)注射液（Plasmalyte A)、l~ 5WT %人血白蛋白溶液等作為細胞的保存介質(zhì)來進行。
[0003] 但是細胞保存的過程中，采用上述骨髓間充質(zhì)干細胞的保存液進行保存，在需要 保存時間較短時（4h內(nèi)）細胞的性質(zhì)和變化還能維持在比較正常的水平，細胞活性降低的 程度還不會大幅降低治療的品質(zhì)。但是如果保存的時間上進一步增加，進行稍長時間的保 存時，首先細胞具有表型異變、活性降低、聚集成團等傾向和性狀變化更加明顯，這些都會 降低細胞的品質(zhì)影響治療的效果，而上述保存液本身不具有緩解或者降低這些保存過程中 問題的能力；并且上述保存液本身營養(yǎng)配比不適當、成分比較單一、細胞外環(huán)境滲透壓維持 不夠力度，也不太能滿足稍長時間保存的要求；同時保存液還不具有抵抗外界污染的能力， 遇到污染時骨髓間充質(zhì)干細胞不具有良好的競爭性抑制能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明實施的目的在于克服現(xiàn)有通常骨髓間充質(zhì)干細胞保存液的缺陷，提供一種 能較好地保持細胞活性，并減緩和修復(fù)細胞損傷的骨髓間充質(zhì)干細胞保存液。
[0005] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實施例的技術(shù)方案如下：
[0006] -種骨髓間充質(zhì)干細胞保存液，該骨髓間充質(zhì)干細胞保存液為含有1. 5~3WT % 肝素、0. 5~1. 5WT %透明質(zhì)酸和1~3WT %海藻糖的基礎(chǔ)液；
[0007] 其中，所述基礎(chǔ)液為包括1. 5~2. 5mmol/L的L-谷氨酰胺、20~30mmol/L HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸）、0. 6~1. 4mmol/L丙酮酸鈉以及90~110mg/L硫酸慶大霉 素的水溶液。
[0008] 本發(fā)明的上述骨髓間充質(zhì)干細胞保存液，以基礎(chǔ)液作為保存液的基礎(chǔ)，提供基本 的必要營養(yǎng)成分以維持細胞基本的生命代謝，使細胞的代謝程度處于基本的穩(wěn)定狀態(tài)；并 且基礎(chǔ)液多用非離子性緩沖維持穩(wěn)定的滲透壓和電荷強度，從而進一步降低細胞性狀變化 的可能。之后再采用添加的肝素、海藻糖和透明質(zhì)酸的添加成分，進一步對細胞在保存中產(chǎn) 生的損傷或者是表型異變等進行修復(fù)、以及抑制細胞的成團，用以減少細胞損傷并加強細 胞活性的維持效果，從而實現(xiàn)在細胞性狀和活性良好保持下進行保存。
[0009] 在上述骨髓間充質(zhì)干細胞保存液的基礎(chǔ)上，本發(fā)明進一步還提出將其進行骨髓間 充質(zhì)干細胞保存的應(yīng)用。采用本發(fā)明的保存液進行保存的過程中，使骨髓間充質(zhì)干細胞維 持在比較穩(wěn)定的代謝狀態(tài)，且能盡量降低或者減緩在保存過程中出現(xiàn)的細胞損傷的程度， 并且能抑制低水平代謝容易引發(fā)的休眠和凋亡的傾向，最終在保存之后能得到活性更好的 細胞。
【具體實施方式】
[0010] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明 進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0011] 本發(fā)明實例提出一種骨髓間充質(zhì)干細胞保存液，其成分為含有1. 5~3WT%肝素、 0. 5~1. 5WT %透明質(zhì)酸和1~3WT %海藻糖的基礎(chǔ)液；
[0012] 其中，基礎(chǔ)液為包括1. 5~2. 5mmol/L的L-谷氨酰胺、20~30mmol/L HEPES(4-羥 乙基哌嗪乙磺酸）、〇. 6~1. 4mmol/L丙酮酸鈉以及90~110mg/L硫酸慶大霉素的水溶液。
[0013] 本發(fā)明的上述骨髓間充質(zhì)干細胞保存液，以基礎(chǔ)液作為保存液的基礎(chǔ)，提供基本 的必要營養(yǎng)成分以維持細胞基本的生命代謝，使細胞的代謝程度處于基本的穩(wěn)定狀態(tài)；并 且基礎(chǔ)液多用非離子性緩沖維持穩(wěn)定的滲透壓和電荷強度，從而進一步降低細胞性狀變化 的可能。之后再采用添加的肝素、海藻糖和透明質(zhì)酸的添加成分，進一步對細胞在保存中產(chǎn) 生的損傷或者是表型異變等進行修復(fù)、以及抑制細胞的成團，用以減少細胞損傷并加強細 胞活性的維持效果，從而實現(xiàn)在細胞性狀和活性良好保持下進行保存。
[0014] 在本發(fā)明的上述基礎(chǔ)上，基礎(chǔ)液中的成分根據(jù)細胞保存過程中所需的細胞的基本 生命代謝的營養(yǎng)要求以及保存過程能利于細胞性狀維持的功能需要進行成分選定。首先， L-谷氨酰胺（L-glutamine)在氨基酸組分中的有重要作用，谷氨酰胺可以合成核酸和蛋白 質(zhì)，是細胞生長必需成分，而谷氨酷胺缺乏會使細胞生長不良甚至導致細胞死亡。所以本 發(fā)明在保存液中添加一定濃度的L-谷氨酰胺，在保存中滿足細胞基本代謝所需的谷氨酷 胺，維持代謝活動處于相對較低的水平，避免脅迫式的進行大量代謝，反而會大大縮短組織 細胞的壽命和活性。同時，本發(fā)明中添加 L-谷氨酰胺的目的還在于，其在機體內(nèi)能參與消 化道黏膜黏蛋白構(gòu)成成分氨基葡萄糖的生物合成，從而促進黏膜上皮組織的修復(fù)；對其功 能跟蹤發(fā)現(xiàn)用于體外之后其可以有助于細胞膜結(jié)構(gòu)的補充和修復(fù)功能，避免細胞的裂解死 亡；所以，在本發(fā)明保存液中使用還能借助其進行細胞膜的修復(fù)功能。
[0015] 進一步，基礎(chǔ)液中的丙酮酸鈉作為維持基本的能量物質(zhì)，是一種糖代謝的底物。原 本對于人骨髓間充質(zhì)干細胞來說，一般情況下培養(yǎng)或者保存時給定的能源物質(zhì)一般都是葡 萄糖，相比細胞保存的要求，保存過程中所需的細胞代謝途徑盡量不要過于復(fù)雜，以免容易 導致誘發(fā)細胞產(chǎn)生性狀變異；所以，在實驗對比之后，采用丙酮酸鈉進行基礎(chǔ)能源物質(zhì)來維 持細胞的基本代謝要求。
[0016] 同時，基礎(chǔ)液中的硫酸慶大霉素是一種堿性的氨基糖苷類廣譜抗生素，對多種革 蘭陰性菌及陽性菌都具有抑菌和殺菌作用。對綠膿桿菌、產(chǎn)氣桿菌、肺炎桿菌、沙門氏菌屬、 大腸桿菌及變形桿菌等革蘭陰性菌和金葡菌等作用較強。本發(fā)明在基礎(chǔ)液中添加硫酸慶大 霉素可以防止在保存下中極有可能發(fā)生的細菌污染，提升干細胞在受到污染時的競爭性優(yōu) 勢。并且，本發(fā)明中采用硫酸慶大霉素作為抗生素的原因還在于其是氨基糖苷類物質(zhì)，是常 用的靜態(tài)抗菌素，相比雙抗的青霉素和鏈霉素，其穩(wěn)定性更強；添加雙抗之后，青霉素在4 度溫度下1~2天后基本就完全降解失效了，而且抗生素種類越多越容易引起細胞的形態(tài) 改變，這對于本發(fā)明提升骨髓間充質(zhì)干細胞的保存品質(zhì)是不利的，所以，在機理對比和反復(fù) 試驗考量之后，本發(fā)明采用添加90~110mg/L的硫酸慶大霉素進行。
[0017] 同時，在上述三種基礎(chǔ)液成分確定之后，基礎(chǔ)液中進一步添加20~30mmol/L HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸），HEPES是一種非離子兩性緩沖液，相比離子型的磷酸鹽緩沖 液，緩沖效果更加穩(wěn)定一些；自身有利于保持保存液滲透壓的持久穩(wěn)定。
[0018] 整體上，由于細胞一般比較通常所最適的滲透壓耐受范圍260~320mmol/L，同時 結(jié)合本發(fā)明中細胞保存中各成分所起的功能，所以調(diào)整各成分的濃度為上述描述的濃度。
[0019] 進一步在基礎(chǔ)液的基礎(chǔ)上，其中還添加有三種細胞功能成分，其中，肝素具有抗炎 生物活性，可以使之能夠?qū)辜毎４孢^程中引起細胞損傷的炎性因子的作用，一方面可 以抑制細胞損傷的進一步加深、另一方面利于修復(fù)。同時，肝素本身也是一種糖胺聚糖，其 分子表面豐富的電荷可能使其與細胞膜表面產(chǎn)生相互作用而起到一定的穩(wěn)定作用，減少細 胞損傷。而海藻糖是由兩個葡萄糖分子以1，1-糖苷鍵構(gòu)成的非還原性糖，其能在細胞表面 能形成獨特的保護膜，有效地保護蛋白質(zhì)分子不變性失活，從而維持生命體的生命過程和 生物特征，在細胞的保存過程中，可以抑制細胞在非大量代謝情形下的退化和凋亡。最終， 透明質(zhì)酸增加溶液黏性，使保存液溶液膠體滲透壓也增加，從而防止細胞易出現(xiàn)的破裂狀 態(tài)，為細胞的活性狀態(tài)的維持也提供了基礎(chǔ)。所以，這三種細胞功能成分，結(jié)合基礎(chǔ)液得到 的本發(fā)明上述骨髓間充質(zhì)干細胞保存液，具有更強的細胞生命活性保持能力，同時保存液 自身的滲透壓等等參數(shù)的穩(wěn)定保持上能更加長久，避免了保存液自身環(huán)境易于改變而引起 的細胞性狀變化缺陷。
[0020] 基于上述保存液的成分，在實施的過程中，雖然骨髓間充質(zhì)干細胞的代謝狀態(tài)基 本維持在基礎(chǔ)生命代謝程度，而不存在其他的功能代謝，但是由于本身營養(yǎng)成分種類和量 都較低，保存的過程中半饑餓狀態(tài)的細胞會慢慢向休眠或者凋亡進行轉(zhuǎn)變；所以在實施的 過程中可以在基礎(chǔ)液中添加0. 08~0. 12mmol/L非必需氨基酸；非必需氨基酸的添加可以 有助于完善基本營養(yǎng)成分，補充代謝過程，抑制細胞休眠或者凋亡。當然，對于人骨髓間充 質(zhì)干細胞的基本代謝來說，非必需氨基酸的種類比較多（有十多種），種類越多越容易誘發(fā) 細胞產(chǎn)生多樣性變化，選擇少數(shù)幾種即可。本發(fā)明實施例優(yōu)選選擇半胱氨酸和/或酪氨酸 等半必需氨