一種綿毛馬兜鈴的組織培養(yǎng)繁殖方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種綿毛馬兜鈴的組織培養(yǎng)繁殖方法。
【背景技術(shù)】
[0002]綿毛馬5?鈴(Aristolochia mollissima Hance)，中藥名尋骨風(fēng)，作為傳統(tǒng)的中藥材，舊時(shí)在民間草藥書籍中便具有使用記載，根、莖、根莖及葉可入藥，可治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛，療效顯著，并對(duì)使用份量、食用方法進(jìn)行了記述，如《飲片新參》，而到了現(xiàn)代，中醫(yī)上還將綿毛馬兜鈴錄入《中華本草》、《全國(guó)中草藥匯編》等。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)關(guān)于綿毛馬兜鈴的研究多見于藥理作用的分析，對(duì)化學(xué)成分的研究比較多，如綿毛馬兜鈴油的抗炎作用，并在藥理成分的基礎(chǔ)上研究了成分對(duì)藥物配伍的影響。在實(shí)際應(yīng)用上，打破傳統(tǒng)的使用方法，觀察多例關(guān)節(jié)炎的臨床表現(xiàn)，并制成多種合適病狀的劑型使用，相比傳統(tǒng)的煎服或外用療效更好。國(guó)外主要對(duì)于綿毛馬兜鈴的有效藥用成分進(jìn)行分析、提取，以及化學(xué)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，進(jìn)行綿毛馬兜鈴提取物對(duì)抗癌活性的研究。由于綿毛馬兜鈴具有多種藥用價(jià)值，市場(chǎng)售價(jià)逐漸走高。近年來(lái)由于過(guò)度采挖，使野生綿毛馬兜鈴資源面臨威脅。為保護(hù)該種植物的野生資源，加強(qiáng)對(duì)綿毛馬兜鈴的開發(fā)利用，需大力推廣綿毛馬兜鈴的栽培種植，要實(shí)現(xiàn)其人工栽培，首要解決的問(wèn)題就是種苗的繁育，而運(yùn)用組織培養(yǎng)技術(shù)，可以加速其繁殖速度獲得大量試管苗，滿足種苗市場(chǎng)的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種綿毛馬兜鈴的組織培養(yǎng)繁殖方法，針對(duì)目前綿毛馬兜鈴繁育存在的問(wèn)題，通過(guò)組織培養(yǎng)繁殖，能夠縮短培養(yǎng)周期并快速繁殖出綿毛馬兜鈴優(yōu)質(zhì)種苗，進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)種苗，滿足市場(chǎng)需求。
[0004]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種綿毛馬兜鈴的組織培養(yǎng)繁殖方法，包括以下步驟:
[0005](1)外植體的取材與消毒:取綿毛馬兜鈴剪切成2-3cm的帶芽莖段或l-2cm長(zhǎng)的莖尖，作為外植體進(jìn)行消毒，首先將2-3滴洗潔精滴入裝50ml自來(lái)水的燒杯中，把外植體放入燒杯輕輕攪拌2min，再用棉花清洗外植體表面污垢，自來(lái)水輕微流水沖洗8_10min ;移置超凈工作臺(tái)，用75v/v%Z醇浸泡30s，無(wú)菌水沖洗一遍，然后再用添加了 1-2滴吐溫-20的50ml濃度為0.1￥八％升汞消毒6-8min、無(wú)菌水沖洗3-5次，最后放置消毒好的不銹鋼碟子，剪切成1.0-1.5cm長(zhǎng)的帶芽莖段，獲得無(wú)菌外植體；
[0006](2)無(wú)菌試管苗的獲取:將消毒好的外植體置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)發(fā)芽得到無(wú)菌試管苗，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加5g.L 1瓊脂，30g.L 1蔗糖，0.5mg.L 1的6-芐基腺嘌呤，培養(yǎng)基pH值為5.8，培養(yǎng)條件為:溫度為22_24°C，光照強(qiáng)度1500-20001ux，光照時(shí)間為10-12h/d，培養(yǎng)時(shí)間為15_20d ；
[0007](3)試管苗增殖培養(yǎng):將無(wú)菌試管苗置于增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)獲得大量不定芽，所述增殖培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加5g.!/瓊脂，20g*L 1蔗糖，0.1-1.0mg.L 1的6-芐基腺嘌呤、0.01-0.5mg.L 1的萘乙酸，培養(yǎng)基pH值為5.8，培養(yǎng)條件為:溫度為
22-24°C，光照強(qiáng)度1500-20001ux，光照時(shí)間為10_12h/d，培養(yǎng)時(shí)間為30d ；
[0008](4)試管苗壯苗培養(yǎng):將繁殖后的不定芽置于壯苗培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗培養(yǎng)得到健壯植株，所述壯苗培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加5g.L 1瓊脂，20g.L 1蔗糖，0.1-1.0mg.L 1的6-芐基腺嘌呤、0.01-0.5mg.L 1的萘乙酸，培養(yǎng)基pH值為5.8，培養(yǎng)條件為:溫度為22-24°C，光照強(qiáng)度1500-20001UX，光照時(shí)間為10_12h/d，培養(yǎng)時(shí)間為30d ;
[0009](5)試管苗生根培養(yǎng):將健壯植株置于生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到完整的帶根苗，所述生根培養(yǎng)基以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加5g.L 1瓊脂，20g.L 1蔗糖，0.5-1.5mg.L 1的萘乙酸，培養(yǎng)基pH值為5.8，培養(yǎng)條件為:溫度為22-24°C，光照強(qiáng)度1500-20001ux，光照時(shí)間為10-12h/d，培養(yǎng)時(shí)間為25d ；
[0010](6)試管苗煉苗移栽:篩選完整的帶根苗進(jìn)行煉苗后移植于基質(zhì)中培養(yǎng)，再移栽至大田；
[0011 ] 步驟(6)中的煉苗移栽按以下操作進(jìn)行:經(jīng)過(guò)步驟(5)獲得帶根的完整植株，待苗長(zhǎng)至5-6cm，根長(zhǎng)至2-4cm時(shí)，選擇生長(zhǎng)良好、整齊、健壯的瓶苗，在室溫為23-25 °C的室內(nèi)進(jìn)行煉苗，并在瓶中加水淹沒培養(yǎng)基，煉苗5-7d，取出試管苗，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到基質(zhì)中生長(zhǎng)40-50d，再移栽至大田。
[0012]所述基質(zhì)為按珍珠巖:蛭石:泥沙=1:2 ; 1的比例混合。
[0013]本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)在于:
[0014]<1>通過(guò)綿毛馬兜鈴不定芽的誘導(dǎo)和繁殖，能保持原始品種的性狀，能夠在短期內(nèi)繁殖得到大量性狀一致的植株，滿足生產(chǎn)需要，并為提供優(yōu)良性狀的綿毛馬兜鈴工廠化育苗提供參考。
[0015]<2>所用MS和1/2MS固體培養(yǎng)基包含大量和微量元素，添加的6_芐基腺嘌呤、萘乙酸、吲哚乙酸和吲哚丁酸等化學(xué)藥劑，成本較低廉、濃度適宜，具體作用如下:在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加6-BA和NAA，能夠誘導(dǎo)不定芽萌發(fā)；在增殖培養(yǎng)基中添加6-BA、NAA和IAA能夠促進(jìn)芽的增殖；在壯苗培養(yǎng)基中添加6-BA和NAA能夠促進(jìn)苗壯和芽的再次增殖；在1/2MS生根培養(yǎng)基中添加IBA和NAA可促進(jìn)苗生根，經(jīng)煉苗后移栽至裝基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)杯。
[0016]<3>培養(yǎng)30d芽繁殖系數(shù)可達(dá)5.5倍，經(jīng)過(guò)擴(kuò)繁、壯苗和生根培養(yǎng)，組培苗生根率達(dá)90.7%以上，移栽基質(zhì)后成活率在87.5%以上，有效解決了綿毛馬兜鈴的規(guī)?；鐔?wèn)題。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步說(shuō)明。
[0018]實(shí)施例1
[0019]本發(fā)明所述的綿毛馬兜鈴的組織培養(yǎng)繁殖方法的一個(gè)實(shí)例，包括如下步驟:
[0020](1)外植體的取材與消毒:取綿毛馬兜鈴剪切成2-3cm的帶芽莖段及l(fā)-2cm的莖尖作為外植體進(jìn)行消毒；首先將2-3滴洗潔精滴入裝50ml自來(lái)水的燒杯中，把外植體放入燒杯輕輕攪拌2min，再用棉花清洗外植體表面污垢，自來(lái)水輕微流水沖洗8-10min ;移置超凈工作臺(tái)，用75v/v%Z醇浸泡30s，無(wú)菌水沖洗一遍，然后再用添加了 1-2滴吐溫-20的50ml濃度為0.1￥八％升汞消毒6-8min、無(wú)菌水沖洗3-5次，最后放置消毒好的不銹鋼碟子，剪切成l.0-l.5cm長(zhǎng)的帶芽莖段，獲得無(wú)菌外植體。所述無(wú)菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌后的蒸餾水。
[0021](2)無(wú)菌試管苗的獲取:將消毒好的外植體置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)發(fā)芽(溫度為23-25°C，光照強(qiáng)度1500-20001ux，光照時(shí)間為10_12h/d) 15_20d，得到無(wú)菌試管苗；
[0022](3)試管苗增殖培養(yǎng):將無(wú)菌試管苗置于增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)(溫度為23-25°C，光照強(qiáng)度1500-20001UX，光照時(shí)間為10_12h/d) 30d，獲得大量不定芽，不定芽增殖系數(shù)為5.3 ；
[0023](4)試管苗壯苗培養(yǎng):將繁殖后的不定芽置于壯苗培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗培養(yǎng)(溫度為23-25°C，光照強(qiáng)度1500-20001ux，光照時(shí)間為10_12h/d) 30d，得到健壯植株，不定芽二次增殖系數(shù)為3.4 ；
[0024](5)試管苗生根培養(yǎng):將健壯植株置于MS生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)25d(溫度為
23-25 °C，光照強(qiáng)度1500-2000lux，光照時(shí)間為10-12h/d)，得到完整的帶根苗，生根率為90.7% ；
[0025](6)試管苗煉苗移栽:經(jīng)過(guò)步驟(5)獲得帶根的完整植株，待苗長(zhǎng)至5-6cm，根長(zhǎng)至2-4cm時(shí)，選擇生長(zhǎng)良好、整齊、健壯的瓶苗，在室溫為23-25°C的室內(nèi)進(jìn)行煉苗，并在瓶中加入少量自來(lái)水淹沒培養(yǎng)基，煉苗5-7d，用鑷子取出試管苗，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到基質(zhì)中生長(zhǎng)40-50(1，再移栽至大田，成活率為92%。