數(shù)增加（圖 7C~7E)。相反，將靶向SPIKE的第一（amiRNAl)和第四外顯子（amiRNA4)的兩個amiRNA 前體轉(zhuǎn)化至NIL-SPIKE中以下調(diào)SPIKE (圖3E、3F ;7B)，產(chǎn)生了具有比NIL-SPIKE顯著更低 的TSN和更窄葉子的轉(zhuǎn)基因植物（圖3G、3H)。
[0150] 相對于野生型Taichung 65, nail (功能喪失）突變體Fnl88類似地顯示出降低 的TSN和FLW(圖12)。這些結(jié)果表明SPIKE(來自熱帶粳稻的Nall的新等位基因）與表 達對應(yīng)地增大了穗和旗葉。盡管Nall報告為與生長素極性運輸相關(guān)，但是未觀察到IR64 和NIL-SPIKE之間的吲哚乙酸（IAA)生物合成或運輸?shù)牟町悾▓D13)。轉(zhuǎn)基因分析表明， SPIKE與Nall相同，其影響在葉中葉脈圖案和生長素極性運輸。從自然變異識別的SPIKE 為來自熱帶粳稻的新等位基因，而從突變系中識別的nail為喪失功能的突變。與野生型相 比，nail突變體降低了 TSN，而來自熱帶粳稻的新等位基因在Nall中顯示出增加的TSN。數(shù) 據(jù)顯示，生長素轉(zhuǎn)運活性在穗分化期與TSN相關(guān)。通過增加 TSN，從而增加了 NIL-SPIKE的 谷物產(chǎn)量。
[0151] 通過SPIKE增強秈稻品種的谷物產(chǎn)量
[0152] 為了評價SPIKE在不同的遺傳背景中增加產(chǎn)量的效能，將所述基因基因滲入到新 的高產(chǎn)量的秈稻品種IRRI146(在菲律賓發(fā)布為'NSIC Rcl58'）中。輪回回交至IRRI146 并且標記輔助選擇（MAS)產(chǎn)生了 IRRI146-SPIKE NIL(圖 4A、圖 4B)。由于 IRRI146-SPIKE 與IRRI146具有98%的遺傳同一性，所以SPIKE在IRRI146中的多效性作用（pleiotropic effects)與在 NIL-SPIKE 中的類似。IRRI146-SPIKE 的 GYS、TSN 和 FLW 顯著高于 IRRI146 的GYS、TSN和FLW(圖4C~圖4E)。類似地，將來自YP9的SPIKE導(dǎo)入到具有不同遺傳 和地域背景的五種流行的秈稻品種中。在不同遺傳背景的流行秈稻品種，來自菲律賓的 PSBRcl8 (IR51672-62-2-1-1-2-3)、來自印度尼西亞的Ciherang、來自老撾的TDKl、來自孟 加拉國的BR11、來自印度的Swarna上確認了其效果。對于SPIKE為純合子的植物比輪回親 本具有顯著更高的TSN(圖4F)。
[0153] 材料與方法
[0154] 植物材料
[0155] 通過回交育種，在秈稻品種IR64的遺傳背景中開發(fā)了 334BC3_衍生的IL，其在遺 傳自NPT品種的農(nóng)藝性狀上存在變異。我們選擇了衍生自NPT品種YP9(IR68522-10-2-2) 的具有高 TSN 的 IL:YTH326(IR84640-ll-110-6-4-2-2-4-2-2-3-B)，該 NPT 品種 YP9 (IR68522-10-2-2)衍生自秈稻品種Shennung 89-366和熱帶粳稻地方品種Daringan之 間的雜交（圖5)。使用衍生自IR64和YTH326之間的雜交的BC 4F2群體，在染色體4的長 臂上的SSR標記RM3423和RM17492之間識別了用于高TSN的qTSN4。通過選自BC 4F2群體 的植物的自花授粉而開發(fā)了 NIL-SPIKE并且用于評估農(nóng)藝性狀、轉(zhuǎn)化和表達。
[0156] 攜帶nail的系Fnl88由Kyushu University的國家生物資源項目提供。Fnl88 是由來源于作為供體親本的nail突變體與作為輪回親本的粳稻品種Taichung 65之間的 雜交的BC3子代開發(fā)的。nail基因座定位在染色體4的長臂上的標記CllOO和C600之間。 由于認為Nall與SPIKE相同，所以將Fnl88用于農(nóng)藝表征以比較SPIKE的效果。
[0157] IRRI 146-SPIKE 的開發(fā)
[0158] 高產(chǎn)量秈稻品種IRRI146(IR77186-122-2-2-3)最近在菲律賓發(fā)布為'NSIC Rcl58'。將來自熱帶粳稻巴厘島Ont jer的NPT IR65564-22-2-3與IRRI146之間雜交的子代 回交至IRRI146三次。在每一代中，使用SPIKE-側(cè)翼標記RM5503和RM6909進行MAS。使用 覆蓋所有染色體的116個多態(tài)性SSR標記進行96BC 3Fi植物的全基因組調(diào)查。選擇一株BC3Fi 植物并且自花授粉以在IRRI146遺傳背景中開發(fā)用于SPIKE的NIL。將這種IRRI146-SPIKE 與輪回親本進行農(nóng)藝性狀與谷物產(chǎn)量的比較。
[0159] 具有SPIKE的秈稻品種的開發(fā)
[0160] 通過回交和MAS將SPIKE基因滲入至五個流行品種中： PSBRcl8 (IR51672-62-2-1-1-2-3)(菲律賓）、Ciherang (印度尼西亞）、TDKl (老撾）、 BRll (孟加拉共和國）和Swarna(印度）。將YP9和每個品種之間雜交的子代回交至流行 品種兩次。在每一代中，使用SPIKE-側(cè)翼標記Ind2和RM17487進行MAS。從每個BC 2F2群 體選擇SPIKE的純合植物并且在田間評價TSN。
[0161] SPIKE的表型評價
[0162] 所有的植物均種植于IRRI、洛斯巴尼奧斯、拉古娜、菲律賓的田間，并且評價成熟 期的100CK粒重量、PN、FLW和TSN。在頸（neck)下Icm處切下糖軸（panicle rachis)，并 且在立體顯微鏡下對VBN計數(shù)。在成熟期測量在盆中生長的植物的RDW。
[0163] 為了評價谷物產(chǎn)量，在隨機地塊中種植IR64、NE-SPIKE、IRRI146和 IRRI146-SPIKE，每系四個重復(fù)。每個地塊的面積至少為4. 8m2;在以丘間20cm和行間 25cm播種后的第21天，每丘移植三株植物。作為底肥（basal dressing)，在移植之前的 一天施用N、P和K各30kg/ha，并且在移植后的第2和4周施用30kg/ha N兩次作為追肥 (topdressing)。在成熟期，收獲L Om2的水稻植物（每地塊20丘），在70°C在烘箱中將植 物干燥5天。在14%水分含量的基礎(chǔ)上計算GYS。使用谷粒檢查器（Cervitec 1625Grain Inspector, FOSS Analytical, .HiUergitiiDenmark)評價谷粒M 白，每系四個重復(fù)。
[0164] 高分辨率連鎖圖
[0165] 由SPIKE的雜合BC4F2植物產(chǎn)生的7996BC 4F3植物的基因組DNA提取自鮮葉。具有 側(cè)翼標記RM17450和RM3836之間組合的1073BC 4F3植物的基因組DNA通過十六烷基三甲基 溴化銨方法單獨從凍干葉中提取。選擇表現(xiàn)出RM3423和AGT3之間的重組的41BC 4F3植物 進行自花授粉以產(chǎn)生用于子代測試的BC4F4系。在BC 4F4系中，從代表性重組體中選擇純合 植物并且評價TSN和FLW。將二十二個DNA標記用于圖譜構(gòu)建（表1)。
[0166] 表1 :染色體4上的用于高分辨率定位總小穗數(shù)的QTL的DNA標記
[0167]


[0170] SPIKE 的轉(zhuǎn)化
[0171] 使用引物對8M17-cl由來源于NIL-SPIKE的幼穗的cDNA擴增包含SPIKE的全長 編碼區(qū)的片段。將所述片段連接到玉米泛素啟動子和胭脂堿合成酶終止子之間的二元載 體pCAMBIA1300int-prUbil-tN0S以生成過表體載體。使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，我們將該載體 導(dǎo)入到了 IR64中。通過Southern印跡分析來評價再生植物的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)。對于SPIKE 的基因沉默，使用了 amiRNA方法。使用Web MicroRNA Designer 3軟件設(shè)計兩個21-bp amiRNA 序列一amiRNAl (TATAAGAAGTATGCTGCGCTA (SEQ ID NO: 4)，用于 SPIKE 的第一外顯 子）和 amiRNA4(TTAATATCAAGTTCCAGACGC(SEQ ID N0;5)，用于第四外顯子）。以質(zhì)粒pNW55 作為模板，使用重疊 PCR通過定位誘變來生成amiRNA前體（表1)。將該前體連接到二元載 體pCAMBIA1300int-prUbil-tN0S以生成沉默載體。使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，我們將該載體導(dǎo) 入到了 NIL-SPIKE中。將轉(zhuǎn)基因植物（T。）移植到盆中，并且將T1植物以丘間20cm且行間 30cm移植到溫室中。評價這些植物的TSN和FLW。
[0172] 為了生成啟動子：⑶S載體，使用引物對UP6-1從SPIKE的ATG密碼子上游擴增 1918-bp片段。將該擴增的片段連接到⑶S報告基因的上游的二元載體pCAMBIA0380 (Camb ia, Canberra, ACT, Australia)。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化將這種載體導(dǎo)入到IR64中。對再生植 物的器官進行采樣以分析GUS活性。
[0173] 表達分析和IAA運輸
[0174] 通過使用 RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, California, USA)從各器官中提取總 RNA。為了識別SPIKE的候選基因，使用I μ g總RNA進行RT-PCR。以用于每一候選物的基 因特異性引物使用IyL cDNA進行PCR(表1)。對于在不同器官中的表達的比較，在幼穗 分化始期（panicle initiation stage)提取幼穗、莖、葉鞘、葉和根的總RNA。使用引物對 seq8M17_56 和 ReverTra Ace qPCR RT 試劑盒（Toyobo, Osaka, Japan)以 500ng 總 RNA 進行 RT-PCR。在 LightCycler 480 系統(tǒng)（Roche Applied Science)上，使用引物對 seq8M17-56 以 LightCycler 480SYBR Green I Master Mix，用 l/5cDNA 混合物進行 qRT-PCR 反應(yīng)。將 數(shù)據(jù)歸一化至看家基因泛素（Ubiquitin) (0s01g22490)的表達。
[0175] 通過氣相色譜-選擇離子監(jiān)測-質(zhì)譜（GC-S頂-MS)測量從切胚芽鞘運輸?shù)江傊瑝K (圖13)的IAA的量，以調(diào)查IR64和NIL-SPIKE胚芽鞘中的IAA生物合成速率。為了調(diào)查 IR64和NIL-SPIKE胚芽鞘中的極性IAA運輸，將3 μ M IAA施加到胚芽鞘切段（1. 5~3. Omm) 的頂面上30min，然后在瓊脂塊上將該胚芽鞘溫育lOmin，并且通過上述的GC-S頂-MS測量 運輸?shù)腎AA。
[0176] 在本說明書中提及的所有出版物（包括專利和非專利文獻）通過引用明確地并入 本文。本文中引用的任何文獻的引用不旨在承認前述任一者是相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)。關(guān)于這些 文獻的日期的所有陳述或關(guān)于這些文獻的內(nèi)容的所有表述均基于申請人可獲得的信息并 且不構(gòu)成關(guān)于這些文獻的日期或內(nèi)容的正確性的任何承認。
[0177] 雖然已經(jīng)參照各種且優(yōu)選的實施方式描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解 的是，在不脫離本發(fā)明的實質(zhì)范圍的條件下可以進行各種變化且可以使用等同物來替代其 元素。此外，在不脫離本發(fā)明的實質(zhì)范圍的條件下，可以進行許多修改以使特定的情況或材 料適應(yīng)本發(fā)明的教導(dǎo)。
[0178] 因此，意圖在于本發(fā)明不受限于為實施本發(fā)明所設(shè)想的本文公開的特定實施方 式，并且本發(fā)明將包括落入權(quán)利要求書范圍內(nèi)的所有實施方式。
【主權(quán)項】
1. 一種用于生產(chǎn)具有提高的谷物產(chǎn)量的子代水稻植物的方法，包括： a) 提供包含基因SPIKE的第一水稻植物； b) 使所述第一水稻植物與第二水稻植物雜交以產(chǎn)生子代水稻植物； c) 對所述第二水稻植物分析所述基因SPIKE; d) 識別并選擇包含所述基因SPIKE并且相對于所述第二水稻植物具有提高的谷物產(chǎn) 量的子代水稻植物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述基因SPIKE包含選自于由SEQIDNO: 1、SEQ IDN0:2、SEQIDN0:94、SEQIDN0:95、SEQIDN0:96、SEQIDN0:97、SEQIDN0:98、SEQ IDN0:99、SEQIDN0:100、SEQIDN0:101和SEQIDN0:102構(gòu)成的組中的多核苷酸序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述基因SPIKE包含一種多核苷序列，所述多核 苷酸序列至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至 少 97%、至少 98%、至少 99%或 100% 同一于選自于由SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQID NO:94、SEQIDNO:95、SEQIDNO:96、SEQIDNO:97、SEQIDNO:98、SEQIDNO:99、SEQID NO: 100、SEQIDNO: 101、和SEQIDNO: 102 構(gòu)成的組中的序列。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述基因SPIKE包含一種多核苷酸序列，所述多核 苷酸序列至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少 97%、至少 98%、至少 99%、或 100% 同一于SEQIDN0:2。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述基因SPIKE是通過檢測選自于由RM5503、 RM3423和Ind4構(gòu)成的組中的第一上游分子標記以及選自于由RM6909、AGT3、RM17487、 RM17486和Indl2構(gòu)成的組中的第二下游分子標記來識別的。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述基因SPIKE是通過檢測選自于由RM3423和 Ind4構(gòu)成的組中的第一上游分子標記以及選自于由AGT3、RM17487、RM17486和Indl2構(gòu)成 的組中的第二下游分子標記來識別的，其中所述第一上游分子標記和第二下游分子標記是 使用表1中列示的相應(yīng)的正向引物和反向引物來檢測的。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述基因SPIKE是通過檢測約105個堿基對的第 一分子標記Ind2和約252個堿基對的第二分子標記RM17487來識別的。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述基因SPIKE是通過檢測約105個堿 基對的第一分子標記Ind2 (正向引物：ACAAGAAGCCGGGAAACCTA(SEQIDNO: 27);反 向引物：CTCCTCCGGTCCTCCTTAAC(SEQIDN0:28)以及約252個堿基對的第二分子 標記RM17487(正向引物：CG