一種香蕉無(wú)ms組織培養(yǎng)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種香蕉無(wú) MS組織培養(yǎng)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 香焦（Musa paradisiaca L.)屬于色焦科（Musaceae)、色焦屬（Musa L)，為多年 生大型常綠草本單子葉植物，起源于亞洲熱帶地區(qū)，是世界主要鮮果種類之一。我國(guó)栽培香 蕉的歷史已有兩千多年，是栽培香蕉歷史最悠久的國(guó)家之一，而華南地區(qū)是我國(guó)香蕉的主 產(chǎn)區(qū)，也是香蕉原產(chǎn)地之一。
[0003] 目前，我國(guó)具有商業(yè)價(jià)值的香蕉栽培品種，幾乎全都是營(yíng)養(yǎng)性結(jié)實(shí)，果內(nèi)沒有種子 或者種子完全退化，屬于三倍體（包括AAA基因型、AAB基因型和ABB基因型），具有高度的 雌雄不孕的特性，傳統(tǒng)香蕉繁殖多是采用無(wú)性繁殖方法，即是利用香蕉植株球莖發(fā)生的側(cè) 芽，俗稱吸芽來延續(xù)生命。而通過無(wú)性繁殖，香蕉吸芽多數(shù)都攜有病毒，易造成嚴(yán)重的品種 退化，而使得香蕉的產(chǎn)量降低，品質(zhì)變劣。因此采用傳統(tǒng)繁殖方式繁殖會(huì)給種植者造成嚴(yán)重 的經(jīng)濟(jì)損失。自20世紀(jì)60年代以來，植物組織培養(yǎng)技術(shù)不斷地發(fā)展，并逐步完善成熟，香 蕉組織培養(yǎng)技術(shù)也迅速發(fā)展，再加上香蕉吸芽莖尖的無(wú)毒、增殖率相對(duì)較高等特點(diǎn)，使得香 蕉組織培養(yǎng)技術(shù)成為植物組培技術(shù)應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)最成功的產(chǎn)業(yè)之一。1985年之后，廣 東、廣西、云南、福建、海南等省區(qū)組織培養(yǎng)香蕉試管苗先后取得成功并開始工廠化生產(chǎn)。與 傳統(tǒng)吸芽繁殖相比，香蕉快速繁殖具有能夠迅速推廣優(yōu)良品種，繁殖系數(shù)高，周期短，整齊， 收獲期一致，有利于集約化經(jīng)營(yíng)和商品化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。
[0004] 植物只有在適宜的營(yíng)養(yǎng)條件下，植物細(xì)胞才能正常地分化、分裂，進(jìn)行正常的生長(zhǎng) 發(fā)育。在組織培養(yǎng)過程中所使用的培養(yǎng)基是向外植體提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的場(chǎng)所。一個(gè)完整的 培養(yǎng)基至少包括無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)元素（如包括大量元素和微量元素）、鐵鹽及鰲合劑、糖、無(wú)機(jī)附 加成分、植物激素、其他成分和固體培養(yǎng)基，還需要瓊脂等。常用的培養(yǎng)基是MS(MuraShigeand Skoog)培養(yǎng)基，其在配制時(shí)需要添加大量元素、微量元素有機(jī)物、鐵鹽、蔗糖、激素、瓊 脂和蒸餾水，而激素價(jià)格昂貴，植株生長(zhǎng)容易產(chǎn)生依賴性；且配制時(shí)需分步配制母液，步驟 繁瑣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)以上技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種香蕉無(wú) MS組織培養(yǎng)的方法，使用木薯酒精 厭氧發(fā)酵液替代基本培養(yǎng)基MS，更加環(huán)保，提供了一種綠色、低成本、便捷的香蕉無(wú) MS組織 培養(yǎng)的方法，減少了在培養(yǎng)基配制過程中的資源浪費(fèi)和時(shí)間消耗，為大規(guī)模的組培生產(chǎn)提 供有利條件。
[0006] 對(duì)此，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0007] -種香蕉無(wú) MS組織培養(yǎng)的方法，在香蕉叢生芽增殖階段、繼代階段及生根培養(yǎng)階 段分別采用叢生芽增殖組織培養(yǎng)液、繼代組織培養(yǎng)液和生根組織培養(yǎng)液，所述叢生芽增殖 組織培養(yǎng)液、繼代組織培養(yǎng)液和生根組織培養(yǎng)液均包含木薯酒精厭氧發(fā)酵液培養(yǎng)基。
[0008] 其中，所述木薯酒精厭氧發(fā)酵液培養(yǎng)基為木薯酒精厭氧發(fā)酵原液經(jīng)水稀釋而成， 為無(wú) MS培養(yǎng)基。優(yōu)選的，所述稀釋濃度不高于40%，即將木薯酒精厭氧發(fā)酵原液用水稀釋 成不高于40%重量百分比濃度。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案使用的木薯酒精厭氧發(fā)酵液（簡(jiǎn)稱CAAL)，是木薯加工生產(chǎn)酒 精產(chǎn)出的廢液經(jīng)過特殊的厭氧發(fā)酵工藝處理后的液體，其中，含有氮、磷、鉀、鈣、鎂等營(yíng)養(yǎng) 成分及有機(jī)質(zhì)，可以考慮以此作為培養(yǎng)基，但是因?yàn)槟臼砭凭珔捬醢l(fā)酵液中COD (Chemical Oxygen Demand，化學(xué)需氧量）含量高，其中含有一些物質(zhì)會(huì)對(duì)植物嫩苗的生長(zhǎng)造成副作用， 所以往往本領(lǐng)域的技術(shù)人員也不會(huì)采用酒精厭氧發(fā)酵液作為組織培養(yǎng)基，截至到目前，國(guó) 內(nèi)外對(duì)廢液應(yīng)用于組織培養(yǎng)也未見報(bào)道。
[0010] 采用本發(fā)明的技術(shù)方案，從資源化優(yōu)先和循環(huán)經(jīng)濟(jì)的角度出發(fā)，農(nóng)業(yè)利用是處理 厭氧發(fā)酵液最直接、最有效的方式；且發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)木薯酒精厭氧發(fā)酵原液經(jīng)過 稀釋，并配以營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不但大大的降低了生產(chǎn)成本，變廢為寶，在生態(tài)環(huán)境上更加環(huán)保，符 合目前綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展需求，培養(yǎng)出的香蕉苗也能達(dá)到以前有MS組織培養(yǎng)培養(yǎng)出的苗的 效果，而且生根數(shù)量和粗壯更明顯，返青期早于基本MS培養(yǎng)基，易于組培苗的移栽成活，還 減少在培養(yǎng)基配制過程中的資源浪費(fèi)和時(shí)間消耗，為大規(guī)模的組培生產(chǎn)提供有利條件。
[0011] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述叢生芽增殖組織培養(yǎng)液包括28~32%的木薯酒 精厭氧發(fā)酵液培養(yǎng)基、180~220g/l馬鈴薯汁、2. 5~3. 5mg/l 6-BA(6-芐氨基嘌呤）和 0. 1~0. 3mg/l NAA(萘乙酸），其中所述28~32%的木薯酒精厭氧發(fā)酵液培養(yǎng)基為將 COD (Chemical Oxygen Demand，化學(xué)需氧量）含量為1800~2200mg/L的木薯酒精厭氧發(fā) 酵原液用水稀釋成28~32%的重量百分比濃度，再添加瓊脂粉和糖配制而成。
[0012] 其中，所述馬鈴薯汁為新鮮馬鈴薯?yè)v碎，過濾去渣，留取汁液。
[0013] 本發(fā)明的技術(shù)方案，在組培培養(yǎng)基配置過程中利用木薯酒精厭氧發(fā)酵液取代MS， 并且根據(jù)不同時(shí)期的不同需求，用不同濃度的厭氧液及天然的馬鈴薯汁及激素配比取代以 前的常用培養(yǎng)基和激素配比，不但大大的降低了生產(chǎn)成本，而且變廢為寶，在生態(tài)環(huán)境上更 加環(huán)保，符合目前綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展需求，培養(yǎng)出的香蕉苗也能達(dá)到以前有MS組織培養(yǎng)培養(yǎng) 出的苗的效果，而且生根數(shù)量和粗壯效果較現(xiàn)有采用MS培養(yǎng)基更明顯，返青期早于基本MS 培養(yǎng)基的，易于組培苗的移栽成活，還減少在培養(yǎng)基配制過程中的資源浪費(fèi)和時(shí)間消耗，為 大規(guī)模的組培生產(chǎn)提供有利條件。
[0014] 優(yōu)選的，所述叢生芽增殖組織培養(yǎng)液包括30%的木薯酒精厭氧發(fā)酵液培養(yǎng)基、 200g/l馬鈴薯汁、3. Omg/1 6-BA(6-芐氨基嘌呤）和0· 2mg/l NAA(萘乙酸）。
[0015] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述繼代組織培養(yǎng)液包括23~27%的木薯酒精厭氧 發(fā)酵液培養(yǎng)基和80~120g/l馬鈴薯汁，其中，所述23~27%的木薯酒精厭氧發(fā)酵液培養(yǎng) 基為將C0D含量為1800~2200mg/L的木薯酒精厭氧發(fā)酵原液用水稀釋成23~27%的重 量百分比濃度，再添加瓊脂粉和糖配制而成。
[0016] 優(yōu)選的，所述繼代組織培養(yǎng)液包括25 %的木薯酒精厭氧發(fā)酵液培養(yǎng)基和100g/l 馬鈴薯汁，所述25%的木薯酒精厭氧發(fā)酵液培養(yǎng)基為將COD含量為1800~2200mg/L的木 薯酒精厭氧發(fā)酵原液用水稀釋成25%的重量百分比濃度，再添加瓊脂粉和糖配制而成。
[0017] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述生根組織培養(yǎng)液包括12~18%的木薯酒精厭氧 發(fā)酵液培養(yǎng)基和1. 5~2. 5mg/l 6-BA，其中，所述12~18%的木薯酒精厭氧發(fā)酵液培養(yǎng)基 為將COD含量為1800~2200mg/L的木薯酒精厭氧發(fā)酵原液用水稀釋成12~18%的重量 百分比濃度，再添加瓊脂粉和糖配制而成。
[0018] 本發(fā)明采用的無(wú) MS組織培養(yǎng)的方法中，培養(yǎng)基的配制不需要添加大量元素、微量 元素、有機(jī)物、鐵鹽，根據(jù)香蕉成長(zhǎng)不同時(shí)期的不同需求，用不同濃度的廢液和馬鈴薯汁代 替MS提供營(yíng)養(yǎng)成分，采用本發(fā)明的無(wú) MS的木薯酒精厭氧液培養(yǎng)基對(duì)香蕉進(jìn)行組培，不但對(duì) 香蕉組織培養(yǎng)的三個(gè)不同階段的正常生長(zhǎng)沒有任何影響，反而生根數(shù)量和粗壯更明顯，返 青期早于基本MS培養(yǎng)基，易于組培苗的移栽成活，而且大大的降低生產(chǎn)成本。
[0019] 優(yōu)選的，所述生根組織培養(yǎng)液包括15%的木薯酒精厭氧發(fā)酵液培養(yǎng)基和2. Omg/1 6-8六，所述15%的木薯酒精厭氧發(fā)酵液培養(yǎng)基為將〇)0含量為1800~220011^/1的木薯酒 精厭氧發(fā)酵原液用水稀釋成15%的重量百分比濃度，再添加瓊脂粉和糖配制而成。
[0020] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述叢生芽增殖組織培養(yǎng)液、繼代組織培養(yǎng)液和生根 組織培養(yǎng)液的pH值均為5. 6~5. 8,均包含28~32g/l蔗糖和6. 0~7. Og/Ι瓊脂。
[0021] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述木薯酒精厭氧發(fā)酵液培養(yǎng)基為C0D含量為 2000mg/L的木薯酒精厭氧發(fā)酵原液。
[0022] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述木薯酒精厭氧發(fā)酵原液用水稀釋時(shí)，采用自來水 稀釋。本發(fā)明的技術(shù)方案，采用自來水代替蒸餾水，也節(jié)約了更多的能源物質(zhì)、減少不必要 的浪費(fèi)，將酒精廢液利用到組織培養(yǎng)也屬于先例，實(shí)現(xiàn)資源回收利用，在生態(tài)環(huán)境上更加環(huán) 保，符合目前綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展需求。
[0023] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述的香蕉無(wú) MS組織培養(yǎng)的方法包括以下步驟：
[0024] 步驟A :將香蕉不定芽無(wú)菌切取單個(gè)芽，去除葉片及褐變部分，留取基部不超過 lcm生長(zhǎng)點(diǎn)，轉(zhuǎn)接到所述叢生芽增殖組織培養(yǎng)液中，在24~30°C環(huán)境下，培養(yǎng)30~40天， 光照度1800~22001x，光照時(shí)間15~17h/d ;
[0025] 步驟B :將增殖的叢生芽，分離成單株轉(zhuǎn)入所述繼代組織培養(yǎng)液中，繼代培養(yǎng)28~ 32天，成為中苗；培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度24~30°C，光照度1800~22001x，光照時(shí)間15~ 17h/d ；
[0026] 步驟C :將中苗轉(zhuǎn)入所述生根組織培養(yǎng)液中進(jìn)行生根培養(yǎng)15~20天生根后移栽， 培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度24~30°C，光照度1800~22001x，光照時(shí)間15~17h/d。
[0027] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟A、步驟B和步驟C的培養(yǎng)條件均為：溫度 26~28°C，光照20001x，光照時(shí)間16h/d。
[0028] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0029] 第一，采用本發(fā)明的技術(shù)方案，利用木薯酒精厭氧發(fā)酵液取代MS培養(yǎng)基，并配以 營(yíng)養(yǎng)液，不但對(duì)香蕉組織培養(yǎng)三個(gè)不同階段的正常生長(zhǎng)沒有任何影響，而且大大的降低生 產(chǎn)成本，變廢為寶，在生態(tài)環(huán)境上更加環(huán)保，培養(yǎng)出的香蕉苗也能達(dá)到以前有MS組織培養(yǎng) 培養(yǎng)出的苗的效果，而且生根數(shù)量和粗壯更明顯，返青期早于基本MS培養(yǎng)基，更易于組培 苗的移栽成活。
[0030] 第二，本發(fā)明的技術(shù)方案提供了一種更加環(huán)保、綠色、低成本、便捷的香蕉無(wú) MS組 織培養(yǎng)的方法，該方法減少在培養(yǎng)基配制過程中的資源浪費(fèi)和時(shí)間消耗，為大規(guī)模的組培 生產(chǎn)提供有利條件。
[0031] 第三，實(shí)現(xiàn)資源回收利用，在生態(tài)環(huán)境上更加環(huán)保，符合目前綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展需 求。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面對(duì)本發(fā)明的較優(yōu)的實(shí)施例作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 以下實(shí)施例對(duì)香蕉叢生芽增殖、繼代及生根培養(yǎng)階段進(jìn)行組織培養(yǎng)。
[0035] (一）香蕉無(wú) MS的30 % CAAL培養(yǎng)基芽誘導(dǎo)培養(yǎng)
[0036] 將組培瓶苗（香蕉不定芽），在超凈工作臺(tái)無(wú)菌切取單個(gè)芽，去除葉片及褐變部 分，留取基部不超過lcm生長(zhǎng)點(diǎn)，轉(zhuǎn)接到包含有無(wú) MS的30%木薯酒精厭氧液培養(yǎng)基、200g/ 1馬鈴薯汁、3. Omg/1 6-