一種特早熟桃雜交胚挽救成苗的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種特早熟桃雜交胚挽救成苗的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 果實成熟期在育種上是一項重要的經(jīng)濟性狀。我國南方地區(qū)6月份進入梅雨季 節(jié)，這個時期成熟的桃子受天氣影響，大多品質(zhì)不好，并且雨季影響市民對桃的購買能力， 使得早熟桃在上海地區(qū)的發(fā)展受到制約，但是上海地區(qū)5月底到6月上旬天氣晴朗，雨水 少，如果能把早熟桃成熟期提前到這個時間，將會豐富我國桃品種資源、增加桃果品市場供 應(yīng)，促進南方地區(qū)桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
[0003] 桃成熟早、品質(zhì)好，栽培管理省工，畝產(chǎn)值收入高，因而創(chuàng)造特早熟類型更有重要 意義，也是近代各國果樹育種學(xué)家向往和追求的目標(biāo)之一。但當(dāng)人們旨在創(chuàng)造特早熟新品 種時，卻常常會遇到雜種種胚不育的問題，阻礙著育種工作的進展。
[0004] 激素含量的異常會導(dǎo)致種子敗育。陳偉2000年研究荔枝敗育品種開始出現(xiàn)敗育 時IAA、GA1+3、CTK含量急劇下降，可能是生長促進物質(zhì)含量的不足影響胚的細胞分裂與生 物大分子的合成，造成生理代謝的紊亂及物質(zhì)和能量虧損，使胚不能正常發(fā)育，最終導(dǎo)致敗 育。黃碧光等（1997)年在蕉柑幼果發(fā)育過程中也發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象。
[0005] 胚培養(yǎng)在桃遺傳育種中的應(yīng)用最早開始于1933年，Tukey首先進行了果實生長快 慢與桃胚大小關(guān)系的研究，并開展了桃胚的培養(yǎng)。20世紀(jì)40年代起胚培養(yǎng)技術(shù)開始廣泛 應(yīng)用于果樹育種。近些年來，通過桃胚培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)選育出了許多優(yōu)良品種，特別是早熟品 種。如春蕾、春花、早花露、早霞露、玫瑰露、Mayfire、Golderest、華光、艷光等。
[0006] 但是，在胚挽救過程中，品種基因型、取樣接種時間、培養(yǎng)基種類與相態(tài)、植物生長 調(diào)節(jié)劑、碳源、培養(yǎng)環(huán)境、移栽方式等都會對胚挽救的萌發(fā)率和成苗率產(chǎn)生影響，且各因子 相互作用，特早熟桃由于種胚很小，并且發(fā)育過程中出現(xiàn)敗育現(xiàn)象，其胚培過程需要先讓胚 長大然后再萌發(fā)成苗，操作復(fù)雜，成苗率低，嚴(yán)重限制了特早熟桃的育種效率。
[0007] 因此，很有必要深入開展特早熟桃的胚挽救技術(shù)研究，以提高特早熟桃胚挽救育 種的成苗率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種特早熟桃雜交胚挽救成苗的方法，有效地促進特早熟 桃雜交胚發(fā)育，在離體組織培養(yǎng)條件下能發(fā)育成苗，且萌發(fā)后的試管苗健壯整齊，提高特早 熟桃中胚挽救育種效率。
[0009] 為了達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0010] -種特早熟桃雜交胚挽救成苗的方法，包括以下步驟：
[0011] 1)取樣接種
[0012] 在特早熟桃品種雜交授粉后，摘取七到八分熟果實，對果實消毒，破核取出胚珠， 將胚珠接種在生長培養(yǎng)基中；所述的生長培養(yǎng)基中包含SH培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑、蔗糖 和活性炭；
[0013] 2)胚珠培養(yǎng)
[0014] 將步驟1)中接種至生長培養(yǎng)基中的胚珠進行暗培養(yǎng)，暗培養(yǎng)的溫度為20~28°C， 培養(yǎng)20~40天，得到膨大的胚珠；
[0015] 3)幼胚分化培養(yǎng)
[0016] 將步驟2)中膨大的胚珠剝?nèi)シN皮，得到幼胚，將長度大于1mm的幼胚轉(zhuǎn)接到分化 培養(yǎng)基中，于2~7°C低溫暗培養(yǎng)70~90天，得到打破休眠的胚；
[0017] 4)胚萌發(fā)培養(yǎng)
[0018] 將打破休眠的胚進行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度18~23°C，培養(yǎng)7~15天后得到試管 苗；
[0019] 5)移苗
[0020] 將具有3~6片真葉、5條以上須根的試管苗移栽到基質(zhì)中，移到溫室中進行常規(guī) 管理，得到幼苗，在終霜期后將幼苗移栽到大田中。
[0021] 進一步，步驟1)中對果實消毒的方法為：先用體積分?jǐn)?shù)為70~85%酒精浸沒果 實，消毒10~2011^11，然后用20~30%次氯酸鈉浸沒果實，消毒10~201^11。
[0022] 優(yōu)選地，步驟1)中所述的生長培養(yǎng)基中的植物生長調(diào)節(jié)劑為吲哚乙酸和赤霉素。
[0023] 又進一步，步驟1)中所述的生長培養(yǎng)基包含SH培養(yǎng)基、吲哚乙酸1~2. 5mg/L、赤 霉素0· 5~1. 5mg/L、鹿糖55~65g/L和活性炭0· 5~2. 5g/L。
[0024] 優(yōu)選地，步驟2)胚珠培養(yǎng)中暗培養(yǎng)溫度為22~26 °C，培養(yǎng)25~35天。
[0025] 進一步，步驟3)中的低溫暗培養(yǎng)溫度為4~5°C，所述分化培養(yǎng)基為木本培養(yǎng)基。
[0026] 進一步，步驟5)中移栽入基質(zhì)的試管苗具有5~6片真葉，5條以上須根，基質(zhì)為 進口草炭：珍珠巖=1 :1~3,體積比，將試管苗移栽到基質(zhì)中后罩住保濕，3天后打開透 氣。
[0027] 本發(fā)明的SH (Stewart and Hsu)培養(yǎng)基的pH為5. 8,成分見表1 :
[0028] 表 1

[0030] 本發(fā)明的木本培養(yǎng)基（Woody Plant medium，簡稱WPM培養(yǎng)基）的pH為5. 8,其成 分見表2 :
[0031] 表 2

[0033] 本發(fā)明在特早熟桃品種雜交授粉后，采取七到八分熟的果實，采取時間適宜，若采 樣太早，則胚的生長力低，采樣太晚時果實變軟，不容易取核也容易發(fā)生污染。在接種時要 嚴(yán)禁使用腐爛的果實，在移栽后的管理中立枯病與褐腐病是危害成活的主要病害，要早起 發(fā)現(xiàn)與防治。
[0034] 植物激素是代謝反應(yīng)的產(chǎn)物，同時又在基因，蛋白質(zhì)（酶）和細胞膜等各種水平上 調(diào)節(jié)植物的生命活動。研究表明，胚的大小和形態(tài)受胚乳調(diào)控基因的影響，即胚乳特異基因 通過調(diào)控胚乳發(fā)育影響胚的發(fā)育。Kinoshita等（1999)的研究也發(fā)現(xiàn)，胚乳中Mea基因的 突變會導(dǎo)致胚乳敗育，進而導(dǎo)致胚中途敗育。對體細胞胚進行研究發(fā)現(xiàn)，激素通過調(diào)節(jié)控制 胚胎發(fā)育相關(guān)基因的開啟和關(guān)閉而影響胚胎的發(fā)育。
[0035] 研究表明，胚乳敗育在先，胚隨后發(fā)生敗育，胚的發(fā)育是依賴胚乳提供養(yǎng)料，因此， 胚乳的退化會導(dǎo)致胚的中途敗育。胚和胚乳的生理活性物質(zhì)代謝失調(diào)，使胚乳不能從珠心 得到營養(yǎng)，胚乳不能正常發(fā)育，同時，胚不能釋放出分解酶溶解胚乳，使胚無法從胚乳中吸 收養(yǎng)分，或根本就沒有胚乳可供營養(yǎng)吸收，使胚在饑餓中夭亡。
[0036] 合子胚的發(fā)育是在胚珠中進行的，胚珠中的生長促進物質(zhì)促進了胚胎的細胞分裂 和生長、核酸和蛋白質(zhì)的合成以及光合產(chǎn)物的輸入和積累，這對胚胎的正常發(fā)育無疑是至 關(guān)重要，胚珠中生長促進物質(zhì)虧損可能影響胚胎的細胞分裂和分化，生物大分子的合成和 營養(yǎng)物質(zhì)的輸入，從而阻礙了胚胎的正常發(fā)育，導(dǎo)致胚敗育的發(fā)生，因此，胚珠中生長抑制 物質(zhì)和生長促進物質(zhì)的平衡失調(diào)是導(dǎo)致胚敗育的重要原因。
[0037] 吲哚乙酸（IAA)與赤霉素（GA3)為生長促進物質(zhì)，脫落酸（ΑΒΑ)為生長抑制物質(zhì)， 易敗育和不易敗育品種的（IAA+GA3)/ΑΒΑ比值存在顯著差異，在胚珠敗育的關(guān)鍵期，易敗 育品種的ΙΑΑ和GA3含量比不敗育品種的含量低，（IAA+GA3)/ABA比值低，在胚胎發(fā)育期， IAA與GA3含量虧缺將會導(dǎo)致胚胎發(fā)育停止。
[0038] 本發(fā)明特早熟桃的胚珠培養(yǎng)過程中，添加了外源性生長促進物質(zhì)一吲哚乙酸與赤 霉素，促進了胚珠對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，維持了胚性生長，促進了幼胚的生長。本發(fā)明添加的 吲哚乙酸和赤霉素都能使細胞伸長生長，吲哚乙酸可以直接影響細胞的伸長、分裂和分化， 赤霉素可以促進吲哚乙酸的合成，通過促使合成生長素來實現(xiàn)促使細胞生長的目的，避免 胚敗育的發(fā)生。
[0039] 同時，本發(fā)明的生長培養(yǎng)基中添加了蔗糖，幼胚的生長需要較高濃度的蔗糖，提供 能量的同時，提高了滲透壓，在這種較高的滲透壓下胚珠才能夠長大，另外，本發(fā)明添加的 活性炭有利于吸收胚生長過程中的有害物質(zhì)。
[0040] 本發(fā)明采用了較低的胚萌發(fā)的培養(yǎng)溫度18~23°C，與自然生長條件下桃種子萌 發(fā)的環(huán)境溫度相接近，在較低的培養(yǎng)溫度條件下，獲得的幼苗的株高得到提升，萌發(fā)率比常 規(guī)的培養(yǎng)溫度為28~30°C的條件下提高13~22%，在溫室移栽后存活率提高了 16%，并 且，培養(yǎng)溫度較高時萌發(fā)的幼苗會出現(xiàn)頂部壞死的現(xiàn)象，而本發(fā)明的培養(yǎng)條件下避免了幼 苗出現(xiàn)頂部壞死的現(xiàn)象。
[0041] 本發(fā)明在胚珠培養(yǎng)過程中，使用的分化培養(yǎng)基能夠使胚的生長力（即胚珠在生長 培養(yǎng)基上培養(yǎng)后長度大于1毫米的幼胚數(shù)目X 100% /接種胚珠數(shù)）達到83. 3 %，而常規(guī) 培養(yǎng)則為55% ;長大的胚中正常胚率（即正常胚/所有長度大于1mm的胚數(shù)）提高，所述 的正常胚為在生長培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)束后具有兩瓣規(guī)則子葉的胚，本發(fā)明長大的胚中有88%的 正常胚，而常規(guī)培養(yǎng)僅有12%的正常胚；分化力（即胚在分化培養(yǎng)基上的成苗數(shù)X 100% / 大