骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的保存試劑及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞保存液技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的保存試劑及 其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 干細(xì)胞治療是將具有不斷自我繁殖能力和多向化潛能的干細(xì)胞在體外培養(yǎng)后，再 將其移植入患者受損或缺損組織，從而實現(xiàn)對損傷組織的補(bǔ)充和修復(fù)。而目前能實現(xiàn)人骨 髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離并大規(guī)模培養(yǎng)的細(xì)胞很少，在細(xì)胞培養(yǎng)完成之后，同時還需要對細(xì)胞 進(jìn)行表型檢測、細(xì)胞形狀分析等等，之后將細(xì)胞保存在保存液中，待需要時再進(jìn)行輸注。在 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)后進(jìn)行保存的階段中，既要維持細(xì)胞的基本生命代謝以防止其死 亡，同時又要避免其代謝量過大而繼續(xù)大量增殖產(chǎn)生的大量形狀變異。所以細(xì)胞保存中，都 采用0.9WT%氯化鈉注射液、5WT%葡萄糖注射液、復(fù)方電解質(zhì)注射液（Plasmalyte A)、l~ 5WT %人血白蛋白溶液等作為細(xì)胞的保存介質(zhì)來進(jìn)行。
[0003] 但是細(xì)胞保存的過程中，采用上述MSCs的保存液進(jìn)行保存，在需要保存時間較短 時（4h以內(nèi)）細(xì)胞的性質(zhì)和變化還能維持在比較正常的水平，細(xì)胞活性降低的程度還不會 大幅降低治療的品質(zhì)。但是如果保存的時間上進(jìn)一步增加，進(jìn)行稍長時間的保存時，首先細(xì) 胞具有表型異變、活性降低、聚集成團(tuán)等傾向和性狀變化更加明顯，這些都會降低細(xì)胞的品 質(zhì)影響治療的效果；而上述保存液本身不具有緩解或者降低這些保存過程中問題的能力， 進(jìn)行保存之后細(xì)胞活性大大降低，慢慢轉(zhuǎn)向于休眠或者凋亡。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明實施的目的在于克服現(xiàn)有的缺陷，提供一種能在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞保存中 維持其細(xì)胞代謝狀態(tài)和活性的保存試劑。
[0005] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實施例的技術(shù)方案如下：
[0006] -種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的保存試劑，包括0~100mmol/L的葡萄糖、40~50mmol/ L的甘露醇、24~28mmol/L的磷酸氫二鉀、12~16mmol/L的磷酸二氫鉀、3~4mmol/L的 腺噪呤、1~1. 5mmol/L的肌苷、14~18mmol/L枸橡酸鉀、35~45mmol/L的氯化銨、75~ 80mmol/L的氯化鈉及細(xì)胞抗氧化劑。
[0007] 本發(fā)明的上述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的保存試劑，通過葡萄糖、枸櫞酸鉀少數(shù)幾種營 養(yǎng)維持細(xì)胞基本生命代謝，同時不添加大量豐富的營養(yǎng)避免其大量快速代謝和增殖；并且 進(jìn)一步輔助腺嘌呤、肌苷、甘露醇維持細(xì)胞自身的形態(tài)和性狀，保護(hù)細(xì)胞膜和酶活性的目 的，使保存的過程中細(xì)胞活性不發(fā)生退化；最后以細(xì)胞抗氧化劑抑制細(xì)胞的氧化損傷，相比 現(xiàn)有通常的保存液，保存后細(xì)胞具有更好的活性和品質(zhì)。
[0008] 在本發(fā)明的上述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的保存試劑的基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步還提出其 在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞保存中的應(yīng)用。采用上述保存試劑保存骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在保存中 保護(hù)細(xì)胞的能量產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，使其維持正常結(jié)構(gòu)和功能；并盡量減慢細(xì)胞代謝速度，減少能量 消耗并供應(yīng)能量物質(zhì)，同時還維持細(xì)胞的形態(tài)抑制和分化和損傷，相比現(xiàn)有通常的保存液 保存后細(xì)胞具有更好的活性和形態(tài)。
【具體實施方式】
[0009] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0010] 本發(fā)明實例提出一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的保存試劑，該保存試劑成分包括有 80~100mmol/L的葡萄糖、40~50mmol/L的甘露醇、24~28mmol/L的憐酸氛二鐘、12~ 16mmol/L的憐酸二氛鐘、3~4mmo1 /],的腺噪吟、1~1. 5mmol/L的肌昔、14~18mmo1 /],枸 橡酸鉀、35~45mmol/L的氯化銨、75~80mmol/L的氯化鈉及細(xì)胞抗氧化劑。
[0011] 本發(fā)明的上述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的保存試劑，是基于維持細(xì)胞基本代謝活性的同 時，一方面是保護(hù)細(xì)胞的能量產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，使其維持正常結(jié)構(gòu)和功能；二是盡量減慢細(xì)胞代謝 速度，減少能量消耗并供應(yīng)能量物質(zhì)；并且輔助修復(fù)成分，降低保存過程中的細(xì)胞損傷。
[0012] 其中，細(xì)胞抗氧化劑比較中重要的補(bǔ)充性的細(xì)胞損傷修復(fù)和抑制工程成分，是能 清除自由基和抑制自由基活動的物質(zhì)，能夠預(yù)防自由基的形成，或是在自由基形成之后防 止它們與其他的細(xì)胞分子結(jié)合，從而阻止自由基造成細(xì)胞的衰老和氧化損傷。在實施中，上 述細(xì)胞氧化劑可以采用超氧化物歧化酶（S0D)、谷胱甘肽過氧化物酶、維生素 C、維生素 E及 還原型谷胱甘肽中的一種或多種。
[0013] 當(dāng)然，最優(yōu)選的是超氧化物歧化酶（S0D)，相對是人體不可缺少、重要的氧自由清 除劑，其以不穩(wěn)定的自由基作為催化底物。這種酶對于需氧細(xì)胞的存活是比較重要的，它可 以催化清除超氧自由基，也是目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一的以自由基為底物的酶，所以在維護(hù)生 物機(jī)體內(nèi)自由基產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡中起極其重要的作用。相比其他的基中細(xì)胞抗氧化 劑，其直接清除氧自由基，效果上更加明確，對抑制氧化性細(xì)胞損傷的針對性更強(qiáng)一些。
[0014] 另外，谷胱甘肽過氧化物酶是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的過氧化物分解酶，是以硒半胱氨 酸結(jié)構(gòu)為活性中心，能催化GSH變?yōu)镚SSG，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，從 而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的干擾及損害，主要針對于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損傷修 復(fù)。其他的幾種，維生素 C、維生素 E及還原型谷胱甘肽都是具有還原性的生物成分，能減緩 造成細(xì)胞氧化性損傷的氧化物質(zhì)的氧化損傷。
[0015] 進(jìn)一步在實施的過程中，由于上述細(xì)胞抗氧化劑的類型和成分并不相同，超氧化 物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶是屬于蛋白質(zhì)酶類，維生素 C、維生素 E是屬于還原性維 生素，還原型谷胱甘肽是寡肽，添加的過程中分別按照各自適合的量進(jìn)行添加，相互之間并 不存在統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)用量（酶類是以活力單位U計量、化學(xué)成分以mol、質(zhì)量等方式計量）。 比如，實施中超氧化物歧化酶在保存試劑中控制添加量35000~45000U/L比較適中；谷 胱甘肽過氧化物酶其是過氧化物底物催化酶，相比產(chǎn)生的過氧化物量，控制添加20000~ 25000U/L的濃度范圍即可；維生素 C和維生素 E這兩者添加3~10mm〇l/L即可，在有上 述的酶共同協(xié)作使用時，在上述范圍中采用低量添加；同時，由于還原型谷胱甘肽自身也是 多肽，添加量多有可能會作為C、N源進(jìn)行能源代謝，可能也會誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生分化，控制低量 1~1. 5mmol/L即可，在于上述多種抗氧化劑共同使用時，在上述范圍下可以采用低量添 加。
[0016] 在細(xì)胞氧化損傷良好緩解的情形下，剩下的成分即是在上述保護(hù)細(xì)胞的能量 產(chǎn)生機(jī)構(gòu)使其維持正常結(jié)構(gòu)和功能、以及減慢細(xì)胞代謝速度并供應(yīng)能量物質(zhì)進(jìn)行的采 用。比如，其中葡萄糖作為基本的生命能源；枸櫞酸鉀和氯化鈉維持紅細(xì)胞膜上鈉鉀栗 (Na+-K+-ATPase)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)；腺嘌呤用于維持和恢復(fù)ATP、DPG水平，還能穩(wěn)定干細(xì)胞形 態(tài)；肌苷與磷酸鹽一方面是形成緩沖系，維持環(huán)境pH，同時還可以起到保護(hù)細(xì)胞膜和酶活 性的目的；甘露醇和氯化鈉能維持適合細(xì)胞生存的晶體和膠體物質(zhì)，保持合適的細(xì)胞外滲 透壓，穩(wěn)定細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)。從上述選擇可以看出，并不存在大量的多種營養(yǎng)，在保存中控制 細(xì)胞代謝速度處于較低的水平。
[0017] 在上述基礎(chǔ)功能的立意下，本身骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是屬于比較容易分化的干細(xì) 胞，所以保存試劑如果自身具有了誘導(dǎo)細(xì)胞表型發(fā)生變化的成分，就很有可能會造成細(xì)胞 在保存的過程中產(chǎn)生分化；結(jié)合本案中不添加細(xì)胞因子等具有誘導(dǎo)效果的成分，并用肌苷、 甘露醇以及氯化鈉在外環(huán)境中穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和形態(tài)，可以比較良好地抑制細(xì)胞的表型變 化或發(fā)生分化。
[0018] 同時，保存試劑在使用過程中，很大多數(shù)情形下均是將細(xì)胞置于常規(guī)空間內(nèi)，而不 是無菌環(huán)境，所以有必要進(jìn)一步添加抑制雜菌污染的抗生素試劑；基于本案中對骨髓間充 質(zhì)干細(xì)胞保存的情況，在保存試劑中采用添加5~10mm〇l/L的氯霉素，氯霉素相比其他類 型的抗生素，其屬于抑菌性廣譜抗生素。本發(fā)明中一方面是基于其廣譜性采用，以避免窄譜 性的抗生素的抑菌類型過少而達(dá)不到良好的抑菌效果；另一方面，其主要是抑菌性的類型， 而不是殺菌性的類型；這樣可以最大化地避免對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自身的代謝產(chǎn)生殺傷。
[0019] 同時，本發(fā)明的上述保存試劑在制備的過程中，雖然基本上絕大多數(shù)成分都是水 溶性的（維生素 E屬于脂溶性），同時氯霉素在冷水中溶解比較慢且溶解度非常低；所以本 案的保存液在配置的過程中可以將除細(xì)胞抗氧化劑的酶類之外的成分全部添加完成之后， 整體可能并不能直接完全溶解，而是呈膠狀的懸液，可以采用適當(dāng)加熱至懸液呈現(xiàn)比較均 一之后進(jìn)行分裝和高溫滅菌處理；并且在滅菌處理完成之后，最后再添加超氧化物歧化酶 (S0D)和谷胱甘肽過氧化物酶，以避免提前添加導(dǎo)致在后續(xù)的滅菌處理中變性失活。同時， 由于配置之后，可能并不一定會立即將上述試劑進(jìn)行細(xì)胞保存，而長期存放的過程中超氧 化物歧化酶（S0D)和谷胱甘肽過氧化物酶可能自身可能還是容易降解或者失活，所以長期 保存可以按照上述方式配置好之后冰凍保存；或者是配置完成之后，暫時不添加超氧化物 歧化酶（S0D)和谷胱甘肽過氧化物酶這兩種，而在使用之間添加即可。
[0020] 采用本發(fā)明的上述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的保存試劑，通過葡萄糖、枸櫞酸鉀少數(shù)幾 種營養(yǎng)維持細(xì)胞基本生命代謝，同時不添加大量豐富的營養(yǎng)避免其大量快速代謝和增殖； 并且進(jìn)一步輔助腺嘌呤、肌苷、甘露醇維持細(xì)胞自身的形態(tài)和性狀，保護(hù)細(xì)胞膜和酶活性的 目的，使保存的過程中細(xì)胞活性不發(fā)生退化；最后以細(xì)胞抗氧化劑抑制細(xì)胞的氧化損傷，盡 可能地維持細(xì)胞的活性和品質(zhì)。
[0021] 在本發(fā)明的上述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的保存試劑的基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步還提出其 在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞保存中的應(yīng)用，采用上述保存試劑保存骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在保存中 保護(hù)細(xì)胞的能量產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，使其維持正常結(jié)構(gòu)和功能；并盡量減慢細(xì)胞代謝速度，減少能量 消耗并供應(yīng)能量物質(zhì)，同時還維持細(xì)胞的形態(tài)抑制和分化和損傷，相比現(xiàn)有通常的保存液 保存后細(xì)胞具有更好的活性和形態(tài)。
[0022] 為使本發(fā)明的上述保存試劑的制備在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞保存中實施能更易于本 領(lǐng)域技術(shù)人員的理解和實施參考，同時凸顯出本發(fā)明