一種利用誘導(dǎo)型雌性不育的雜交稻機(jī)械化制種方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種利用誘導(dǎo)型雌性不育的雜交稻機(jī)械化 制種方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國現(xiàn)行雜交稻制種技術(shù)，采取父母本分期播種，多為先播父本，后播母本；父母 本箱式分開栽插，母本多行，父本雙行；收獲時父母本分開收割，或者授粉后成熟前割掉父 本。因此，雜交水稻制種是一項勞動強度大、工序繁瑣、生產(chǎn)成本高的技術(shù)。隨著城鎮(zhèn)化、工 業(yè)化、農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化和農(nóng)村土地流轉(zhuǎn)政策的逐步實施，留守農(nóng)村的青壯年勞動力逐年遞減，現(xiàn) 行勞動密集型、精耕細(xì)作型的制種技術(shù)已無足夠勞動力來承擔(dān)。同時，隨著國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展 和農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，農(nóng)民收入渠道不斷增多，雜交水稻制種這一高風(fēng)險、低回報的生產(chǎn) 模式對農(nóng)戶也缺乏吸引力；而且由于部分農(nóng)民對雜交水稻制種技術(shù)不熟練或覺得制種過程 太繁雜，所以不敢或不愿承擔(dān)雜交水稻制種工作。因此，雜交水稻機(jī)械化制種技術(shù)研究迫在 眉睫。
[0003] 已有不少研究者作了各種嘗試開展雜交稻機(jī)械化制種。有研究者提出用谷殼顏色 區(qū)別水稻不育系和恢復(fù)系種子，具體做法是將正常谷殼色的水稻不育系種子與非正常谷殼 色的水稻恢復(fù)系種子機(jī)械混播，成熟后經(jīng)機(jī)械混收，再用色選機(jī)分選，獲得雜交種；有研究 者提出用飛機(jī)將花粉噴施在母本田塊里進(jìn)行制種；也有研究者提出利用父、母本粒型的較 大懸殊，用粒選機(jī)分選；還有研究者提出用半機(jī)械化操作的方法，即直播母本，人工栽插和 收割父本，最后機(jī)械收割母本等方法；還有研究者利用水稻對除草劑苯達(dá)松的敏感特性進(jìn) 行雜交水稻機(jī)械化制種。然而上述多種方法均存在諸多缺陷而不能從根本上實現(xiàn)雜交水稻 機(jī)械化制種，目前在生產(chǎn)上也未見大規(guī)模商業(yè)化應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用誘導(dǎo)型雌性不育的雜交稻機(jī)械化 制種方法。
[0005] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0006] 所述利用誘導(dǎo)型雌性不育的雜交稻機(jī)械化制種方法包括如下步驟：
[0007] (1)將誘導(dǎo)型啟動子驅(qū)動的水稻雌性可育基因插入水稻表達(dá)載體，水稻表達(dá)載體 優(yōu)選為PCAMBIA1300 ;
[0008] (2)將步驟（1)所制備的水稻表達(dá)載體導(dǎo)入雌性不育水稻，并獲得純合的轉(zhuǎn)基因 水稻；
[0009] (3)將純合的轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行不育系繁殖或雜交稻制種；進(jìn)行不育系繁殖時，向 純合的轉(zhuǎn)基因水稻施加誘導(dǎo)劑，使誘導(dǎo)型啟動子驅(qū)動的水稻雌性可育基因表達(dá)，實現(xiàn)可育 自交繁殖；進(jìn)行雜交稻制種時，在不施加誘導(dǎo)劑的自然條件下將純合的轉(zhuǎn)基因水稻與母本 不育系種植，雜交獲得雜交種子（純合的轉(zhuǎn)基因水稻不施加誘導(dǎo)劑時表現(xiàn)為完全雌性不 育，因而可作為父本用于制種與母本雜交生產(chǎn)雜交種子；制種過程收獲時，父本由于為雌 性不育而不結(jié)實，因此，父母本無論箱式播種或者混播，收獲時都可混收）。
[0010] 其中，步驟（1)所述水稻雌性可育基因為雌性不育水稻sfsl的雌性不育基因的 野生型基因，PTB1雌性基因的野生型基因或FST雌性不育基因的野生型基因；所述雌性不 育水稻sfsl的雌性不育基因序列如SEQIDNO. 1所示；所述PTB1雌性基因序列如SEQID NO. 2所示；所述FST雌性不育基因序列如SEQIDNO. 3所示。
[0011] 步驟（1)所述誘導(dǎo)型啟動子的DNA序列如SEQIDNo. 4所示。
[0012] 步驟（2)所述雌性不育水稻為雌性不育水稻sfsl(該不育系已被申請?zhí)?為201210096970. 7的發(fā)明專利公開）或攜帶PTB1雌性基因（該基因已被申請?zhí)枮?201010194553. 7的發(fā)明專利公開）的雌性不育水稻。
[0013] 步驟（3)所述不育系繁殖時是在雌配子發(fā)育期向純合的轉(zhuǎn)基因水稻施加誘導(dǎo)劑； 所述雌配子發(fā)育期為減數(shù)分裂期至大胞子發(fā)育期。
[0014] 所述誘導(dǎo)劑是丙環(huán)唑、腈菌唑、或丙環(huán)唑與腈菌唑的組合物。
[0015] 雌性不育水稻的繁殖和雜交稻機(jī)械化制種中利用了包含上述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因水 稻進(jìn)行轉(zhuǎn)育所獲得的水稻材料。
[0016] 下面結(jié)合原理，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明：
[0017] 本發(fā)明首先構(gòu)建了攜帶由誘導(dǎo)型啟動子驅(qū)動的水稻雌性可育基因的表達(dá)盒的水 稻表達(dá)載體。利用水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)入雌性不育水稻。不育系繁殖時，上 述轉(zhuǎn)基因水稻利用相應(yīng)的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)重組育性基因表達(dá)，使其可育自交繁殖；雜交稻制種 時，轉(zhuǎn)基因水稻不施加誘導(dǎo)劑時表現(xiàn)為完全雌性不育，因而可作為父本用于制種與母本雜 交生產(chǎn)雜交種子。制種過程收獲時，父本由于為雌性不育而不結(jié)實，因此，父母本可以箱式 播種，也可以混播，收獲時可以混收。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0019] 本發(fā)明方法解決了雌性不育水稻繁殖技術(shù)難題，實現(xiàn)了雜交稻種子生產(chǎn)的混播混 收；繁殖時，施用化學(xué)誘導(dǎo)劑，收獲父本種子。制種時，可以箱式播插，也可以混播；收獲時， 可以混收。這一混播混收的雜交水稻種子生產(chǎn)技術(shù)，可以減少制種操作程序，便于進(jìn)行機(jī)械 化操作，減輕勞動強度，降低種子生產(chǎn)成本，整體提高水稻種業(yè)的效益。
【附圖說明】
[0020] 圖1是實施例1中攜帶由誘導(dǎo)型啟動子驅(qū)動的水稻雌性可育基因的基因表達(dá)盒的 水稻表達(dá)載體圖譜；
[0021] 圖2是實施例3中部分轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測圖（M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1~4 :轉(zhuǎn) 基因植株；5:陰性對照）
[0022] 圖3是實施例3中部分轉(zhuǎn)基因植株的Southernblot檢測圖（一:陰性對照；+ :以 質(zhì)粒作為陽性對照）；
[0023] 圖4是實施例4中轉(zhuǎn)基因植株花粉Ι2_ΚΙ染色結(jié)果圖；
[0024]圖5是實施例4中轉(zhuǎn)基因植株施加誘導(dǎo)劑后的結(jié)實表現(xiàn)（上圖：轉(zhuǎn)基因植株不施 加誘導(dǎo)劑后的結(jié)實表現(xiàn)；下圖：轉(zhuǎn)基因植株施加誘導(dǎo)劑后的結(jié)實表現(xiàn)）；
[0025] 圖6是實施例5中水稻雌性不育系用于繁殖試驗；
[0026]圖7是實施例4中小規(guī)模制種現(xiàn)場圖。
【具體實施方式】
[0027] 下面通過具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但不因此限制本發(fā)明的范圍。所涉 及的菌株、載體、水稻品種都是可以公開獲得。
[0028] 實施例1 :攜帶誘導(dǎo)型啟動子驅(qū)動的水稻雌性可育基因的基因表達(dá)盒的水稻表達(dá) 載體構(gòu)建
[0029]在植物表達(dá)載體pHB上插入1個表達(dá)盒：誘導(dǎo)型啟動子（SEQIDN0. 4)、野生型 PTB1 (水稻雌性可育基因）編碼區(qū)（SEQIDNO. 2)、rbcSPolyA終止子（SEQIDNO. 5)。完 整的表達(dá)盒序列如SEQIDNO.6所示。完整的構(gòu)建載體圖譜見附圖1。
[0030] 所構(gòu)建載體質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株EHA105用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化。導(dǎo)入方法采用電擊 轉(zhuǎn)化方法，主要參考bio-rad公司的電擊儀使用說明書進(jìn)行，具體步驟如下：
[0031] (1)將儲存于_80°C的DH10B感受態(tài)細(xì)胞取出放在冰上凍融，1mm電激杯放在冰上 預(yù)冷，把凍存的S0C放置在37°C解凍。
[0032] (2)將干凈的EP離心管插在冰上預(yù)冷，一般EP離心管的數(shù)目比要轉(zhuǎn)化的樣品多 兩個，一個用來做陰性對照（沒有加入DNA)、另一個做陽性對照（加入1μ1的10ng/μ1 pUC19)〇
[0033] (3)分別吸取1-2μ1要轉(zhuǎn)化的DNA樣品放入預(yù)冷的ΕΡ離心管中，然后將融化的 DH10B感受態(tài)細(xì)胞20μ1輕輕取出放入預(yù)冷的EP離心管底部，輕輕的將兩者混勻，盡量不 要產(chǎn)生氣泡，離心管底部不要用手接觸，避免溫度變化對感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率造成影響，操作過 程盡量的快。
[0034] (4)設(shè)置轉(zhuǎn)化參數(shù)，1800ν，25μF，200Ω，1mm，BioRad電激儀一般有推薦的使用參 數(shù)。
[0035] (5)輕輕吸取感受態(tài)和DNA混合物，放入電激杯中，輕敲使混合物均勻的分布于杯 底，改上蓋子放入電激槽中，關(guān)上安全蓋，按下電激紅色按鈕，待電激完成后（一般會儀器 會發(fā)出完成提示音），將在37°C預(yù)熱好的S0C放入電激杯中，將混合物旋起，用吸頭將混合 物轉(zhuǎn)入搖菌管中，于37°C恒溫?fù)u床，225rpm，lhr。
[0036] 實施例2 :轉(zhuǎn)基因水稻獲得
[0037] 2. 1植物材料選擇
[0038] 用于遺傳轉(zhuǎn)化的水稻（OryzasativaL.)品種選擇為對應(yīng)的攜帶PTB1基因（SEQ IDNO. 1)的水稻雌性不育系。
[0039] 2. 2水稻胚性愈傷組織的誘導(dǎo)
[0040] 取授粉后10_15(1的未成熟水稻種子剝?nèi)シN皮，于70%酒精浸泡31^11，再于0.1% 升汞中浸泡15min(或再轉(zhuǎn)入20 %的次氯酸鈉溶液中于搖床振蕩滅菌25min)，超凈工作臺 中無菌水清洗3-5次，將消毒后種子的幼胚用鑷子擠出，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個皿約放 35粒，28°C暗培養(yǎng)4一5d，切除胚根，繼續(xù)培養(yǎng)12-15d，待愈傷長大后進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每兩周 繼代一次，共繼代2-3次。
[0041]成熟胚去殼，經(jīng)上述方法消毒后，置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。28°C暗培養(yǎng)至長出愈傷組 織。選用培養(yǎng)或預(yù)培養(yǎng)4天的愈傷組織作為轉(zhuǎn)化材料。
[0042] 2· 3愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)
[0043] 取生長旺盛的胚性愈傷組織（從繼代培養(yǎng)上挑選分散狀，顏色鮮黃的2 - 3mm的 胚性愈傷顆粒）轉(zhuǎn)接到預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基，27°C暗培養(yǎng)3 - 4天。生長旺盛的愈傷用于轉(zhuǎn)化。
[0044] 2. 4農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化
[0045] 農(nóng)桿菌的培養(yǎng)。挑農(nóng)桿菌單菌落接種于含50mg/LYM培養(yǎng)基上，260C暗培養(yǎng)2~ 3天后，用一金屬匙收集農(nóng)桿菌菌體，將其懸浮于AAM液體懸浮培養(yǎng)基中。調(diào)整菌落濃度至 0.D. 600為0. 8~1. 0,即可用于轉(zhuǎn)化。
[0046] 愈