性技術是如下：將無菌微纖維 (2 μ g)懸浮在150 μ 1的含有約10 μ g的混合雙鏈寡核苷酸的植物培養(yǎng)基中。使懸浮培養(yǎng) 物沉降并且將等體積的壓積細胞和無菌纖維/核苷酸懸浮液渦旋10分鐘并接種。立即或 在達約120小時的延遲情況下（如對于特定性狀適當?shù)模┦┘舆x擇性培養(yǎng)基。
[0062] 電穿孔
[0063] 在替代實施方案中，重組基因寡核堿基可根據(jù)本領域的普通技術人員熟知的 技術通過來源于植物部分的原生質體的電穿孔遞送至植物細胞。參見，例如Gallois 等，1996,Methods in Molecular Biology 55:89-107, Humana Press, Totowa, N. J. ；Kipp 等，1999，Methods in Molecular Biology 133:213_221，Humana Press，Totowa，，N.J. 〇
[0064] 重組基因寡核堿基還可通過電穿孔引入小孢子中。在釋放四分體之后，小孢子 是單核的且薄壁的。它在外孢壁形式之前擴大且發(fā)育芽孔。在此階段小孢子比其他植物 細胞潛在更易于用外源DNA轉化。此外，小孢子發(fā)育可體外改變以產(chǎn)生可再生成植物的單 倍體胚或胚性愈傷組織（Coumans 等，Plant Cell Rep. 7:618-621，1989 ;Datta 等，Plant Sci. 67:83-88, 1990 ;Maheshwari 等，Am. J Bot. 69:865-879, 1982 ;SchaefTer，Adv. In Cell Culture 7:161-182, 1989 ;Swanson 等，Plant Cell R印.6:94-97, 1987)。因此，轉化的小 孢子可在通過標準方法染色體加倍之后直接再生成單倍體植株或雙單倍體可育植株。還參 見標題為Compositions and Methods for Plant Genetic Modification 的共同未決申請 美國系列號09/680, 858,其以引用的方式并入本文。
[0065] 小孢子電穿孔方法描述于Jardinaud等，Plant Sci. 93:177-184, 1993以及 Fennell 和 Hauptman, Plant Cell Reports 11:567-570, 1992 中。用于將MDON 電穿孔至植 物原生質體中的方法也可適用于小孢子電穿孔。
[0066] 晶須和顯微注射
[0067] 在又一個替代實施方案中，重組基因寡核堿基可通過植物細胞的晶須或顯微注射 遞送至植物細胞。所謂的晶須技術基本上如Frame等，1994, Plant J. 6:941-948中所描述 來進行。將重組基因寡核堿基添加至晶須且用于轉化植物細胞。重組基因寡核堿基可與包 含編碼能夠在植物細胞中形成重組酶復合物的蛋白質的序列的質粒共孵育，以使得在寡核 苷酸與靶序列之間催化重組。
[0068] 植物的選擇
[0069] 在不同實施方案中，如本文所公開的植物可以是雙子葉植物、單子葉植物或裸子 植物的任何物種，包括作為樹或灌木生長的任何木本植物物種、任何草本物種或產(chǎn)生食用 水果、種子或蔬菜的任何物種或產(chǎn)生彩色或芳香花的任何物種。例如，植物可選自由以下 組成的組的植物物種：芥花、向日葵、玉米、煙草、甜菜、棉花、玉米、小麥、大麥、水稻、苜蓿、 大麥、高粱、西紅柿、芒果、桃子、蘋果、梨、草莓、香蕉、甜瓜、土豆、胡蘿卜、萵苣、洋蔥、大豆、 大豆屬、甘蔗、豌豆、鷹嘴豆、紫花豌豆、蠶豆、扁豆、蘿卜、蕪菁甘藍、球芽甘藍、羽扇豆、花椰 菜、羽衣甘藍、菜豆、楊樹、松樹、桉樹、葡萄、柑橘、黑小麥、苜蓿、黑麥、燕麥、草皮和牧草、亞 麻、油菜、芥菜、黃瓜、牽牛花、香脂、辣椒、茄子、萬壽菊、蓮花、卷心菜、菊花、康乃馨、郁金 香、鳶尾、百合以及產(chǎn)堅果植物（在它們尚未具體地提及的情況下）。
[0070] 可使用本領域中通常已知的方法針對對除草劑的抗性或耐受性對植物和植物細 胞進行測試，例如通過在存在除草劑的情況下生長植物或植物細胞且測量相較于在不存在 除草劑情況下的生長的生長速率。
[0071] 如本文所用，植物、植物器官、植物組織或植物細胞的基本上正常生長被定義為植 物、植物器官、植物組織或植物細胞的生長率或細胞分裂率為表達野生型AHAS蛋白的對應 植物、植物器官、植物組織或植物細胞的生長率或細胞分裂率的至少35%、至少50%、至少 60 %或至少75%。
[0072] 如本文所用，植物、植物器官、植物組織或植物細胞的基本上正常發(fā)育被定義為植 物、植物器官、植物組織或植物細胞中的一個或多個發(fā)育事件的出現(xiàn)與在表達野生型蛋白 質的對應植物、植物器官、植物組織或植物細胞中發(fā)生的那些發(fā)育事件基本上相同。
[0073] 在某些實施方案中，本文提供的植物器官包括但不限于葉、莖、根、葉芽、花芽、分 生組織、胚芽、子葉、胚乳、萼片、花瓣、雌蕊、心皮、雄蕊、花藥、小孢子、花粉、花粉管、胚珠、 子房和果實或從其取得的切片、薄片或盤。植物組織包括但不限于愈傷組織、基本組織、維 管組織、貯藏組織、分生組織、葉片組織、莖組織、根組織、冠癭組織、植物腫瘤組織以及再生 組織。植物細胞包括但不限于具有細胞壁的分離的細胞、其各種大小的聚集體以及原生質 體。
[0074] 當與由類似經(jīng)受的非耐受樣植物提供的相比，植物當其經(jīng)受相關除草劑時是對所 述除草劑基本上"耐受性的"并且提供轉移至右側的劑量/響應曲線。這類劑量/響應曲 線具有繪制在X軸上的"劑量"和繪制在y軸上的"致死百分比"、"除草作用"等。耐受性 植物將需要比非耐受性樣植物更多的除草劑，以便產(chǎn)生給定除草作用。當經(jīng)受在通常由農(nóng) 用化學品團體用于殺死地中的雜草的濃度和比例下的除草劑時，對除草劑基本上"抗性"的 植物展示很少（如果有）壞死、溶解、褪綠或其他損害。對除草劑具有抗性的植物還是能夠 容忍除草劑的。
[0075] 植物的產(chǎn)生
[0076] 植物物種的不同組織的組織培養(yǎng)和自其再生植物是已知的。例如，通過組織培 養(yǎng)繁育芥花栽培品系在以下的任一者中描述但不限于以下中的任一者=Chuong等，"A Simple Culture Method for Brassica hypocotyls Protoplasts, ''Plant Cell Reports 4:4-6, 1985 ；Barsby, T. L.,等，〃A Rapid and Efficient Alternative Procedure for the Regeneration of Plants from Hypocotyl Protoplasts of Brassica napus，''Plant Cell Reports (Spring,1996) ；Kartha, K.,等，"In vitro Plant Formation from Stem Explants of Rape，"Physiol. Plant，31:217-220，1974 ;Narasimhulu，S.， 等，〃Species Specific Shoot Regeneration Response of Cotyledonary Explants of Brassicas，''Plant Cell Reports (Spring 1988) ;Swanson，E.，''Microspore Culture in Brassica，"Methods in Molecular Biology，第 6 卷，第 17 章，第 159 頁，1990〇
[0077] 變種的進一步繁殖可通過組織培養(yǎng)和再生發(fā)生。大豆的不同組織的組織培養(yǎng)和自 其再生植物是熟知的和廣泛公布的D例如，可參考Komatsuda，T.等，〃Genotype X Sucrose Interactions for Somatic Embryogenesis in Soybeans，''Crop Sci. 31:333-337, 1991 ； Stephens,P. A.,等，"Agronomic Evaluation of Tissue-Culture-Derived Soybean Plants，"Theor.Appl.Genet. 82:633-635,1991 ;Komatsuda，T.等，"Maturation and Germination of Somatic Embryos as Affected by Sucrose and Plant Growth Regulators in Soybeans Glycine gracilis Skvortz and Glycine max(L. )Merr. "Plant Cell, Tissue and Organ Culture，28:103-113, 1992 ;Dhir，S. et al. ,Regeneration of Fertile Plants from Protoplasts of Soybean(Glycine max L. Merr.) ；Genotypic Differences in Culture Response，"Plant Cell Reports 11:285-289, 1992 ;Pandey，P. 等，〃Plant Regeneration from Leaf and Hypocotyl Explants of Glycine wightii(ff. and A. ) VERDC. var. longicauda，"Japan J. Breed. 42:1-5, 1992 ;以及 Shetty，K.， 等，〃Stimulation of In Vitro Shoot Organogenesis in Glycine max(Merrill. )by Allantoin and Amides，"Plant Science 81:245-251，1992cXollins等的 1991 年6月 18 日 頒布的美國專利號5, 024, 944和Ranch等的1991年4月16日頒布的美國專利號5, 008, 200 特此以引用的方式整體并入本文。
[0078] 以下實施例說明本發(fā)明的實踐，但不應被視為限制其范圍。
[0079] 實施例1:通過經(jīng)由基因修復宴核苷酉$ (GRON)與在靶向堿基變化附近裂解的轉錄 活化因子樣效應子核酸酶（TALEN)對的組合引入靶向單核苷酸突變顯著改進轉基因擬南 芥細胞中的藍色熒光蛋白（BFP)至綠色熒光蛋白（GFP)的轉化。
[0080] 通過本領域的技術人員已知的方法產(chǎn)生具有藍色熒光蛋白基因的多個拷貝的擬 南芥品系（參見例如，Clough和Brent, 1998)。用此品系建立源自根的分生組織培養(yǎng)物，其 用于原生質體分離和培養(yǎng)（參見例如，Mathur等，1995)。GRON遞送至原生質體中通過聚乙 二醇（PEG)介導的GRON攝取至原生質體中來實現(xiàn)。使用與由Fujiwara和Kato (2007)描 述的方法類似的使用96孔型式的方法。在以下簡要描述方案。所給出的體積是施加至96 孔培養(yǎng)皿的單獨孔的體積。
[0081] L 將 6. 25 μ 1 的 GR0N/TALEN 混合物（80 μ M BFP4 編碼 /41 聚體 GR0N)與 25 μ 1 的擬南芥BFP轉基因根分生組織源性的原生質體在于96孔板的每個孔中5χ106個細胞/ml 下進行混合。。