一種劍葉龍血樹疏松愈傷組織誘導(dǎo)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物疏松愈傷組織誘導(dǎo)方法，特別是一種劍葉龍血樹的疏松愈傷組織誘導(dǎo)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]劍葉龍血樹（Dracaena cochinchinensis (Lour) S. C. Chen)又名千年木、血竭樹、交趾龍血樹，是漸危種，屬國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物。劍葉龍血樹具有很高的藥用價(jià)值，從其樹脂提取的血竭被稱為麒麟竭，為我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，在我國(guó)已有1500年以上的使用歷史。據(jù)《本草綱目》記載，龍血竭性溫、平，味甘、咸，無(wú)毒，入血分，歸肺、脾、腎三經(jīng)，具有活血化瘀、消腫止痛、收斂止血，軟堅(jiān)散結(jié)，生肌斂瘡等顯著功效，有“活血圣藥”的美譽(yù)，主要分布云南、廣西、海南等地。
[0003] 近年來(lái)，由于其需求量大再加上高昂的價(jià)格致使人們對(duì)劍葉龍血樹野生資源實(shí)施了不合理的掠奪性采伐，劍葉龍血樹野生資源日趨枯竭，瀕臨滅絕，已經(jīng)被國(guó)際上很多國(guó)家列為珍稀瀕危保護(hù)植物。因此利用生物技術(shù)對(duì)其進(jìn)行組培快繁尤為重要。對(duì)劍葉龍血樹的研究主要在藥物化學(xué)成分、組織培養(yǎng)等方面的研究，目前尚未有細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方面研究的報(bào)道。疏松愈傷組織容易散碎，增殖能力旺盛，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期繼代保存而不喪失胚性，有利于愈傷組織建立優(yōu)良的懸浮系，并且在需要時(shí)能從中分離出全能性的原生質(zhì)體。通過(guò)探究不同激素對(duì)劍葉龍血樹愈傷組織的影響，篩選出快速生長(zhǎng)、疏松型愈傷組織的最佳激素配比，為進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)劍葉龍血樹總生物堿提供材料，為保護(hù)和合理開發(fā)劍葉龍血樹提供技術(shù)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種劍葉龍血樹的疏松愈傷組織誘導(dǎo)的方法，它能夠短時(shí)間產(chǎn)生增殖能力旺盛的疏松愈傷組織、為進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)劍葉龍血樹總生物堿提供材料。
[0005] 本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案達(dá)到上述目的：一種劍葉龍血樹的疏松愈傷組織誘導(dǎo)的方法，包括以下步驟：
[0006](1)外植體的消毒：先用洗潔精水溶液清洗外植體表面污垢，置于燒杯中進(jìn)行流水沖洗5?8min，然后移至超凈工作臺(tái)上，用75v/v%酒精將種子和芽浸泡30s，無(wú)菌水沖洗1遍，再用0. lv/v% HgCl2浸泡，時(shí)間分別為8、12、15min，無(wú)菌水浸泡3次，用無(wú)菌濾紙吸干外植體表面水分后進(jìn)行接種，其中無(wú)菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌的蒸餾水；所述外植體為飽滿種子或種子播種于河沙里萌發(fā)的芽；
[0007](2)無(wú)菌苗的獲得：將步驟⑴得到的外植體接種于MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強(qiáng)度20?30 ymol/m2 · s，光照時(shí)間為12h/d的條件下培養(yǎng)8?15d便開始出芽，隨后長(zhǎng)出無(wú)菌苗，所述MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0. 5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、〇. lmg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5. 8 ;
[0008](3)培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)效果：將步驟（2)中得到的無(wú)菌苗接種于MS、B5、N6三種基本培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強(qiáng)度20?30 μ mol/m2 *s，光照時(shí)間為12h/d的條件下培養(yǎng)25?30d，逐漸產(chǎn)生疏松愈傷組織，所述MS、B5、N6三種基本培養(yǎng)基中分別添加0. 5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0. 2mg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8 ;
[0009](4)培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織的繼代效果：將步驟（3)中得到的愈傷組織置于MS繼代培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度25±2°C，光照強(qiáng)度20?30 ymol/m2 · s，光照時(shí)間為10h/d的條件下培養(yǎng)10d，切口端逐漸膨大，形成較多疏松的愈傷組織，所述MS繼代培養(yǎng)基中添加0. 1?2. Omg/L的6-芐基腺嘌呤6-ΒΑ、0· 5?3. Omg/L的2, 4-二氯苯氧乙酸2, 4-D，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5. 8。
[〇〇1〇]本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)在于：
[0011](1)通過(guò)取劍葉龍血樹種子或芽進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，能夠在短時(shí)間內(nèi)培育出大量長(zhǎng)勢(shì)良好的劍葉龍血樹疏松愈傷組織，為劍葉龍血樹建立懸浮系提供優(yōu)良材料。
[0012](2)本發(fā)明涉及升汞、酒精，MS、B5、N6基本培養(yǎng)基和6-芐基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和2, 4-二氯苯氧乙酸2, 4-D。MS具有較高的無(wú)機(jī)鹽濃度，能夠提供組織生長(zhǎng)所需的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，從而加速愈傷組織的生長(zhǎng)。B5培養(yǎng)基的主要特點(diǎn)是含有較低的銨，銨這一營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)培養(yǎng)基有抑制生長(zhǎng)的作用。N6培養(yǎng)基特點(diǎn)是謂03和（順4)#04含量高。
[0013](3)所用消毒劑、激素等化學(xué)藥品價(jià)格低廉，試驗(yàn)成本低。
[0014](4)采用本發(fā)明所述的培養(yǎng)方法得到的劍葉龍血樹愈傷組織培養(yǎng)40d誘導(dǎo)率達(dá)85%以上，產(chǎn)生的愈傷組織生長(zhǎng)快，大部分為嫩綠色、乳白色顆粒狀的疏松型愈傷組織。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步說(shuō)明。
[0016]實(shí)施例1
[0017]本發(fā)明所述的劍葉龍血樹的疏松愈傷組織誘導(dǎo)的方法的一個(gè)實(shí)例，包括如下步驟：
[0018](1)外植體的消毒：先用洗潔精水溶液清洗外植體表面污垢，置于燒杯中進(jìn)行流水沖洗5?8min，然后移至超凈工作臺(tái)上，用75v/v%酒精將種子和芽浸泡30s，無(wú)菌水沖洗1遍，再用0. lv/v% HgCl2浸泡，時(shí)間分別為8、12、15min，無(wú)菌水浸泡3次。用無(wú)菌濾紙吸干外植體表面水分后進(jìn)行接種，其中無(wú)菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌的蒸餾水；所述外植體為飽滿種子或種子播種于河沙里萌發(fā)的芽；
_9](2)無(wú)菌苗的獲得：將步驟⑴得到的外植體分別接種于MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強(qiáng)度20?30 μ mol/m2 · s，光照時(shí)間為12h/d的條件下培養(yǎng)8?15d，便開始出芽，隨后長(zhǎng)出無(wú)菌苗。所述MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還加入0. 5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0. lmg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5. 8 ;
[0020](3)培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)效果：將步驟（2)中得到的無(wú)菌苗分別接種于MS、
B5、N6三種基本培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強(qiáng)度20?30 μπιο?/m2 *s，光照時(shí)間為12h/d的條件下培養(yǎng)25?30d，逐漸產(chǎn)生疏松愈傷組織。所述MS、B5、N6基本培養(yǎng)基中還加入0. 5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0. 2mg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5. 8 ;MS、B5、N6三種基本培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率分別為為62. 9%、57. 1%、51. 4%，MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織生長(zhǎng)旺盛、結(jié)構(gòu)疏松，其次為B5培養(yǎng)基，以N6為培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率最低，顏色淺黃、愈傷組織質(zhì)地緊密，褐化率最高；
[0021](4)培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織的繼代效果：將步驟（3)中得到的愈傷組織置于MS繼代培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強(qiáng)度20?30 ymol/m2 · s，光照時(shí)間為12h/d的條件下培養(yǎng)10d后，切口端逐漸膨大，形成較多疏松的愈傷組織，所述MS繼代培養(yǎng)基中還加入0· 1?2. Omg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0. 5mg/L的2, 4-二氯苯氧乙酸2, 4-D，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5. 8,愈傷組織誘導(dǎo)率最高為77. 1 %，顏色淡黃或淺綠色，結(jié)構(gòu)疏松。
[0022]實(shí)施例2
[0023](1)外植體的消毒：先用洗潔精水溶液清洗外植體表面污垢，置于燒杯中進(jìn)行流水沖洗5?8min，然后移至超凈工作臺(tái)上，用75v/v%酒精將種子和芽浸泡30s，無(wú)菌水沖洗1遍，再用0. lv/v% HgCl2浸泡，時(shí)間分別為8、12、15min，無(wú)菌水浸泡3次。用無(wú)菌濾紙吸干外植體表面水分后進(jìn)行接種，其中無(wú)菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌的蒸餾水；所述外植體為飽滿種子或種子播種于河沙里萌發(fā)的芽；
[0024](2)無(wú)菌苗的獲得：將步驟（1)得到的外植體分別接種于MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強(qiáng)度20?30 μ mol/m2 · s，光照時(shí)間為12h/d的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)8?15d便開始出芽，隨后長(zhǎng)出無(wú)菌苗。所述外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，還加入0. 5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0. lmg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊月旨，培養(yǎng)基的pH值為5.8 ;
[0025](3)培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)效果：將步驟（2)中得到的無(wú)菌芽為外植體接種于MS基本培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強(qiáng)度20?30 μ mol/m2 · s，光照時(shí)間為12h/d的條件下培養(yǎng)，25?30d逐漸產(chǎn)生疏松愈傷組織。所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別為MS基本培養(yǎng)基，還加入0. 5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0. 2mg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5. 8 ;
[0026](4)培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織的繼代效果：將步驟（3)中得到的愈傷組織置于MS繼代培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度25±2°C，光照強(qiáng)度20?30 μ mol/m2 *s，光照時(shí)間為10h/d的條件下培養(yǎng)，接種10d后，切口端逐漸膨大，形成較多疏松的愈傷組織，所述愈傷組織繼代培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，還加入0. 5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0. lmg/L的2, 4-二氯苯氧乙酸2, 4-D，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5. 8,愈傷組織誘導(dǎo)率為65. 7%，顏色淺綠色，結(jié)構(gòu)緊密。
[0027]實(shí)施例3
[0028](1)外植體的消毒：先用洗潔精水溶液清洗外植體表面污垢，置于燒杯中進(jìn)行流水沖洗5?8min，然后移至超凈工作臺(tái)上，用75v/v%酒精將種子和芽浸泡30s，無(wú)菌水沖洗1遍，再用0. lv/v% HgCl2浸泡，時(shí)間分別為8、12、15min，無(wú)菌水浸泡3次。用無(wú)菌濾紙吸干外植體表面水分后進(jìn)行接種，其中無(wú)菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌的蒸餾水；所述外植體為飽滿種子或種子播種于河沙里萌發(fā)的芽；
[0029](2)無(wú)菌苗的獲得：將步驟（1)得到的外植體分別接種于MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25 ±2°C，光照強(qiáng)度20?30 μ mol/m2 · s，光照時(shí)間為12h/d的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)8?15d便開始出芽，隨后長(zhǎng)出無(wú)菌苗。所述外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，還加入0. 5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0. lmg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊月旨，培養(yǎng)基的pH值為5