一種實驗室快速檢測轉(zhuǎn)抗草甘膦基因棉花方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及檢測轉(zhuǎn)基因棉花領(lǐng)域，具體涉及一種實驗室快速檢測轉(zhuǎn)抗草甘膦基因棉花方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，國內(nèi)對轉(zhuǎn)抗草甘膦基因棉花的檢測主要采取兩種方法，分子檢測和生物學檢測。常用的抗草甘膦棉花分子檢測主要是檢測相應基因片段的大小及插入位點等，分子檢測需要專業(yè)分子生物學技術(shù)人員來操作，通常需要專業(yè)儀器進行分子標記檢測、southern雜交檢測、western雜交檢測等等。生物學檢測周期長，需要將其種入大田，在棉花生長季節(jié)中多次噴施草甘膦2%。以檢測不同生長階段的耐受性，檢測效果較易受到周圍環(huán)境及自然因素的影響造成檢測的較大差異；所需種子量較多，較難以在早期獲得轉(zhuǎn)基因植株收到極少量種子時檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明為了解決現(xiàn)有檢測轉(zhuǎn)抗草甘膦基因棉花技術(shù)繁瑣、周期長、準確度低、耗資多、所需種子量大等問題，提供了一種實驗室快速檢測轉(zhuǎn)抗草甘膦基因棉花的方法。
[0004]為了解決【背景技術(shù)】中所存在的問題，它具體包括以下操作流程:
[0005]步驟一、種子的準備:種子經(jīng)硫酸脫絨一晾干一選取生長健壯的種子適當量放入三角瓶一加入占種子總重75%的乙醇消毒30s —再放入占種子總重15%的過氧化氫中消毒3_4h —無菌水中洗3次；
[0006]步驟二、檢測培養(yǎng)基的制備:MS(524)粉末、硝酸鉀、有機元素、葡萄糖，調(diào)節(jié)pH值至5.8，添加瓊脂作為凝固劑，瓊脂的濃度為7g/L，高壓滅菌15分鐘；檢測培養(yǎng)基中添加草甘膦的濃度依次為 1%。、0.8%。、0.6%。、0.4%。、0.2%。、0.1%。、0。
[0007]步驟三、播種:無菌操作臺上把種子剝?nèi)ネ鈿ひ环湃霗z測培養(yǎng)基上(每個三角瓶中放入3粒種子)—三角瓶封口后放于培養(yǎng)架光照培養(yǎng)5-7天；
[0008]步驟四、檢測:依棉花植株生長受損情況進行檢測。
[0009]由于采用了以上技術(shù)方案，本發(fā)明具有以下有益效果:
[0010](1)不抗草甘膦棉花只有在不加草甘膦的培養(yǎng)基上能夠正常生長，在添加任何濃度草甘膦的培養(yǎng)基上都表現(xiàn)出嚴重生長不良。抗草甘膦棉花在不加草甘膦及草甘膦濃度為0.4%。、0.2%。、0.1%。時，生長差異不大，均未受影響，0.6%。濃度時表現(xiàn)較明顯受抑制表型，0.8%。和1%。濃度時抑制更加明顯。因此，可將0.6%。的濃度作為實驗室快速篩選抗草甘膦棉花的濃度；
[0011](2)這種方法簡單，使用種子少，時間短，能快速在實驗室進行檢測，耗資也低。
【附圖說明】
[0012]為了更清楚地說明本發(fā)明，下面將結(jié)合附圖對實施例作簡單的介紹。
[0013]圖1是75%乙醇消毒棉花種子；
[0014]圖2是15%過氧化氫消毒棉花種子；
[0015]圖3是無囷水浸泡棉花種子；
[0016]圖4是棉花種子去殼播種于培養(yǎng)基；
[0017]圖5是不抗草甘膦棉花在草甘膦濃度為0的培養(yǎng)基中發(fā)育情況；
[0018]圖6是不抗草甘膦棉花在草甘膦濃度為0.1%。的培養(yǎng)基中發(fā)育情況；
[0019]圖7是不抗草甘膦棉花在草甘膦濃度為0.2%。的培養(yǎng)基中發(fā)育情況；
[0020]圖8是不抗草甘膦棉花在草甘膦濃度為0.4%。的培養(yǎng)基中發(fā)育情況；
[0021]圖9是不抗草甘膦棉花在草甘膦濃度為0.6%。的培養(yǎng)基中發(fā)育情況；
[0022]圖10是不抗草甘膦棉花在草甘膦濃度為0.8%。的培養(yǎng)基中發(fā)育情況；
[0023]圖11是不抗草甘膦棉花在草甘膦濃度為1%。的培養(yǎng)基中發(fā)育情況；
[0024]圖12是抗草甘膦棉花在草甘膦濃度為0的培養(yǎng)基中發(fā)育情況；
[0025]圖13是抗草甘膦棉花在草甘膦濃度為0.%。的培養(yǎng)基中發(fā)育情況；
[0026]圖14是抗草甘膦棉花在草甘膦濃度為0.2%。的培養(yǎng)基中發(fā)育情況；
[0027]圖15是抗草甘膦棉花在草甘膦濃度為0.4%。的培養(yǎng)基中發(fā)育情況；
[0028]圖16是抗草甘膦棉花在草甘膦濃度為0.6%。的培養(yǎng)基中發(fā)育情況；
[0029]圖17是抗草甘膦棉花在草甘膦濃度為0.8%。的培養(yǎng)基中發(fā)育情況；
[0030]圖18是抗草甘膦棉花在草甘膦濃度為1%。的培養(yǎng)基中發(fā)育情況。
【具體實施方式】
[0031]為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述。
[0032]實施例1
[0033]—種實驗室快速檢測轉(zhuǎn)抗草甘膦基因棉花方法，它具體包括以下操作流程:
[0034]步驟一、種子的準備:種子經(jīng)硫酸脫絨一晾干一選取生長健壯的種子適當量放入三角瓶一加入75%乙醇消毒30s (參看圖1)—再放入15%過氧化氫中消毒3-4h(參看圖2)—無菌水中洗3次(參看圖3);
[0035]步驟二、檢測培養(yǎng)基的制備:MS(524)粉末、硝酸鉀、有機元素、葡萄糖，調(diào)節(jié)pH值至5.8，添加瓊脂作為凝固劑，瓊脂的濃度為7g/L，然后高壓滅菌15分鐘，檢測培養(yǎng)基中添加草甘膦的濃度依次為 1%。、0.8%。、0.6%。、0.4%。、0.2%。、0.1%。、0。
[0036]步驟三、播種:無菌操作臺上把抗草甘膦棉花種子剝?nèi)ネ鈿ひ环湃霗z測培養(yǎng)基上(每個三角瓶中放入3粒種子)—三角瓶封口后放于培養(yǎng)架光照培養(yǎng)5-7天；另取一組不抗草甘膦棉花種子播種于相同檢測培養(yǎng)基作為對照(參看圖4);
[0037]步驟四、檢測:培養(yǎng)7天后依棉花植株生長受損情況進行檢測。具體方法是觀察幼苗發(fā)育情況。參看圖5-11，不抗草甘膦棉花受抑制較明顯，在未加草甘膦的萌發(fā)培養(yǎng)基中可以正常生根萌發(fā)，根系長根毛多，初生葉大，鮮綠，下胚軸長；在0.1%。?1%。草甘膦濃度的培養(yǎng)基上生長均嚴重受到抑制，根系不發(fā)育，根部變黑無根毛，初生葉小且發(fā)黃，下胚軸未伸長。參看圖12-18，抗草甘膦棉花具有一定的抗性，在0.1%。、0.2%。、0.4%。草甘膦濃度的培養(yǎng)基中生長基本未受影響，幼苗發(fā)育情況與不加草甘膦的培養(yǎng)基中幼苗發(fā)育一致，根系長根毛多，初生葉大，鮮綠，下胚軸長，幼苗生長良好；在0.6%。草甘膦濃度培養(yǎng)基中發(fā)育受到一定影響，根部變黑，根毛減少，下胚軸較短；在0.8%。草甘膦濃度培養(yǎng)基中，根部進一步變黑，根毛基本沒有，下胚軸更短，初生葉發(fā)黃；在1%。草甘膦濃度培養(yǎng)基中根部基本不發(fā)育，根部變黑無根毛，初生葉發(fā)黃，下胚軸不伸長。因此，在萌發(fā)培養(yǎng)基中加入0.6%。濃度草甘勝，可以實現(xiàn)實驗室快速檢測抗草甘勝棉花。
[0038]所述MS(524)粉末、硝酸鉀、有機元素、葡萄糖的種類和添加量為本領(lǐng)域?qū)嶒炄藛T所公知的常識，調(diào)節(jié)pH值、配制草甘膦濃度技術(shù)為實驗室常用技術(shù)，所述的草甘膦濃度單位％，為質(zhì)量體積比(w/v)，其體積為添加草甘膦前培養(yǎng)基的總體積。
[0039]實施例2
[0040]—種實驗室快速檢測轉(zhuǎn)抗草甘膦基因棉花方法，在實驗室把轉(zhuǎn)草甘膦基因棉花種子經(jīng)消毒后種入特制的檢測培養(yǎng)基中，于培養(yǎng)間常規(guī)培養(yǎng)5-7天時依據(jù)棉花生長受損情況進行檢測。棉株生長正常為耐草甘膦，非正常為不耐草甘膦。通過篩選發(fā)現(xiàn)，可將0.6%。的濃度作為實驗室快速篩選抗草甘膦棉花的濃度。這是一種簡單、快速、低耗較為理想的實驗室檢測技術(shù)。
[0041]通過篩選發(fā)現(xiàn)，不抗草甘膦棉花只有在不加草甘膦的培養(yǎng)基上能夠正常生長，在添加任何濃度草甘膦的培養(yǎng)基上都表現(xiàn)出嚴重生長不良?？共莞熟⒚藁ㄔ诓患硬莞熟⒓安莞熟舛葹?.4%。、0.2%。、0.1 %。時，生長差異不大，均未受影響，0.6%。濃度時表現(xiàn)較明顯受抑制表型，0.8%。和1%。濃度時抑制更加明顯。因此，可將0.6%。的濃度作為實驗室快速篩選抗草甘膦棉花的濃度。
[0042]最后應說明的是:以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應當理解，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的精神和范圍。
【主權(quán)項】
1.一種實驗室快速檢測轉(zhuǎn)抗草甘膦基因棉花方法，其特征在于它具體包括以下操作流程: 步驟一、種子的準備:種子經(jīng)硫酸脫絨一晾干一選取生長健壯的種子適當量放入三角瓶一加入占種子總重75%的乙醇消毒30s —再放入占種子總重15%的過氧化氫中消毒.3-4h —無菌水中洗3次； 步驟二、檢測培養(yǎng)基的制備:MS(524)粉末、硝酸鉀、有機元素、葡萄糖，調(diào)節(jié)pH值至.5.8，添加瓊脂作為凝固劑，瓊脂的濃度為7g/L，高壓滅菌15分鐘；檢測培養(yǎng)基中添加草甘膦的濃度依次為 1‰、0.8‰、0.6‰、0.4‰、0.2‰、0.1‰、0。 步驟三、播種:無菌操作臺上把種子剝?nèi)ネ鈿ひ环湃霗z測培養(yǎng)基上(每個三角瓶中放入3粒種子)—三角瓶封口后放于培養(yǎng)架光照培養(yǎng)5-7天； 步驟四、檢測:依棉花植株生長受損情況進行檢測。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種實驗室快速檢測轉(zhuǎn)抗草甘膦基因棉花方法，具體包括以下操作流程：步驟一、種子的準備：種子經(jīng)硫酸脫絨→晾干→選取生長健壯的種子適當量放入三角瓶→加入占種子總重75％的乙醇消毒30s→再放入占種子總重15％的過氧化氫中消毒3-4h→無菌水中洗3次；步驟二、檢測培養(yǎng)基的制備：MS(524)粉末、硝酸鉀、有機元素、葡萄糖，調(diào)節(jié)pH值至5.8，添加瓊脂作為凝固劑，瓊脂的濃度為7g/L，高壓滅菌15分鐘；檢測培養(yǎng)基中添加草甘膦的濃度依次為1‰、0.8‰、0.6‰、0.4‰、0.2‰、0.1‰、0；步驟三、播種。本發(fā)明方法簡單，使用種子少，時間短，能快速在實驗室進行檢測，耗資也低。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105340743
【申請?zhí)枴緾N201510791495
【發(fā)明人】張樹偉, 馬燕斌, 張義茹, 王新勝, 吳霞, 張相斌, 韓青龍, 李燕娥
【申請人】山西省農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年11月11日