一種甘草無性快速繁殖方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物組培領(lǐng)域，具體涉及一種利用組織培養(yǎng)技術(shù)無性快速繁殖甘草的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)是?科甘草屬多年生草本植物，分布于我國北方干旱、半干旱地區(qū)的曖溫帶、寒溫帶大陸型季風(fēng)候區(qū)，海拔高度250-1400米，年平均氣溫3-10°C。甘草莖葉為牲畜良好飼料，根有重要經(jīng)濟價值，是中藥材中第一位的大宗中藥材，也是我國傳統(tǒng)的出口創(chuàng)匯大宗藥材，同時，甘草還是食品、煙草、化妝品等行業(yè)中的重要原材料。為滿足生產(chǎn)和市場對甘草的需求，迫切需要開展大面積的人工種植。甘草的實踐生產(chǎn)繁殖通常采用種子育苗和根狀莖繁殖，但種子萌發(fā)率一般只有5-10% (于林清等1999)，采用根狀莖切分進(jìn)行根狀莖繁殖，用種量大，影響甘草的產(chǎn)量，且繁殖系數(shù)低，長期用根莖繁殖易感染病毒，導(dǎo)致種質(zhì)退化，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)。運用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，將植物莖尖或腋芽在培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到脫毒試管苗，在解決品種退化問題，短時間內(nèi)獲得大量的優(yōu)良無性系，加快重要經(jīng)濟植物的栽培生產(chǎn)中起著極其重要的作用。因此，甘草快速繁殖技術(shù)的研發(fā)，將是實現(xiàn)工廠化、標(biāo)準(zhǔn)化快速獲得大量優(yōu)質(zhì)甘草種苗的重要保障。
[0003]目前已有對甘草進(jìn)行無菌苗繁殖的研究:利用種子、嫩莖、根狀莖獲得無菌苗，以頂芽誘導(dǎo)或腋芽為外植體誘導(dǎo)叢生芽、以誘導(dǎo)體細(xì)胞愈傷組織分化為芽或以花藥誘導(dǎo)愈傷組織分化為芽再誘導(dǎo)叢生芽的發(fā)生等途徑繁殖芽，經(jīng)生根誘導(dǎo)獲得無菌苗。以上所有的培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基(見Murashige T, Skoog F(1962)A revised medium for rapid growthand b1assay with tobacco tissue cultures.Phys1l Plant 15:473 - 497)添加多種激素。采用的激素有:萘乙酸(NAA 0.1?2mg/L)、6_芐氨基嘌呤(6-BA 0.2?4mg/L)、2，4二氯苯氧乙酸(2，4_D 0.5?lmg/L)、口引噪乙酸(IAA 0.1?lmg/L)、口引噪丁酸(IBA 0.1?lmg/L)、6_糠基氨基嘌呤(KT 0.2?2mg/L)。2012年6月27日，藺海明和柳福智獲得授權(quán)專利“甘草優(yōu)質(zhì)種苗快速繁殖的方法”(專利號為ZL201110024490.5)，該發(fā)明將種子接種MS培養(yǎng)基萌發(fā)培養(yǎng)無菌苗，后切取無菌苗的莖桿，接入MS+KH2P0410mg/L+NAA 0.5mg/L培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)獲得無菌苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、出苗快，能高效地?zé)o性繁殖多個甘草種的甘草無性快速繁殖方法。
[0005]本發(fā)明對甘草多個品種進(jìn)行了大田枝條取材培養(yǎng)無菌苗，以腋葉和頂芽為外植體快速繁殖增殖芽，為甘草無性繁殖提供一種操作簡單、設(shè)備要求低、繁殖快、再生苗成活高、適用于多個甘草品種的無性快速繁殖的方法，可為甘草產(chǎn)業(yè)人工種植提供大量優(yōu)質(zhì)種苗。
[0006]本發(fā)明的甘草無性快速繁殖方法，包括以下步驟:
[0007]a.無菌苗的培養(yǎng):取甘草嫩枝并切除葉片，消毒后，將甘草嫩枝切成至少帶有1個腋芽的莖段外植體，然后將莖段外植體接種到培養(yǎng)基中，待腋芽生根枝條伸長至含有5?8個腋芽，得到無菌苗；
[0008]b.無菌苗的繼代增殖:將無菌苗切成頂芽外植體、至少帶有1個腋芽的莖段外植體和至少帶有1個腋芽和根的外植體，將上述外植體接種到新的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到繼代增殖的無菌苗；
[0009]c.無菌苗的移栽:將繼代增殖的無菌苗取出，洗掉根部培養(yǎng)基，移栽至栽培基質(zhì)中培養(yǎng)，得到甘草種苗；
[0010]所述的步驟a和b的培養(yǎng)基的配方為:每升培養(yǎng)基含有0.lmg IBA,余量為訊03和ΝΗ4Ν03用量均減半的MS培養(yǎng)基，pH5.8。
[0011]甘草種苗可以移到大田中培養(yǎng)。
[0012]所述的謂03和NH 4N03用量均減半的MS培養(yǎng)基，是指ΚΝ0 3和NH 4N03用量相對于常規(guī)MS培養(yǎng)基中的謂03和NH 4勵3用量減半，其他相同。
[0013]優(yōu)選，所述的甘草為烏拉爾甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)、光果甘草(Radix Glycyrrhizae Glabrae)或脹果甘草(Glycyrrhiza inf lata Batalin) 0
[0014]優(yōu)選，所述的步驟a的消毒是將甘草嫩枝用自來水沖洗10分鐘后，放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的多菌靈溶液中浸泡5-10分鐘，再用自來水洗滌5次，將嫩枝切成5厘米長莖段，用體積分?jǐn)?shù)為75%酒精浸泡30秒，用無菌水沖洗1遍后，將莖段取出置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為
0.1 %的升汞溶液消毒10分鐘，再用無菌水沖洗6遍，用無菌紙將莖段水分吸干，得到消毒后的甘草嫩枝。
[0015]優(yōu)選，所述的步驟c的栽培基質(zhì)是將沙、蛭石和營養(yǎng)土按質(zhì)量比為1:1:2混合均勻而得。
[0016]優(yōu)選，所述的步驟c的移栽至栽培基質(zhì)中培養(yǎng)，是將洗掉根部培養(yǎng)基的繼代增殖的無菌苗栽入栽培基質(zhì)中，蓋上保鮮膜，在膜上打些小孔，置于22±1 °C，光強50?ΙΟΟμπιοΙ πΓ?光照12h/天條件下培養(yǎng)，7天后揭去保鮮膜，繼續(xù)培養(yǎng)3天后，移至玻璃溫室培養(yǎng)，得到甘草種苗。
[0017]本發(fā)明的無菌苗的培養(yǎng)和無菌苗的繼代增殖，在培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，其培養(yǎng)溫度和光照條件為甘草組培的常規(guī)培養(yǎng)溫度和光照條件，優(yōu)選為:22±1°C、光強50?ΙΟΟμπιοΙnT2s-1、光照 12h/ 天。
[0018]所述的MS培養(yǎng)基為國際通用的培養(yǎng)基，其成份和配置方法見Murashige T, SkoogF(1962)A revised medium for rapid growth and b1assay with tobacco tissuecultures.Phys1l Plant 15:473 - 497。
[0019]本發(fā)明提供了一種甘草無性快速繁殖方法，具有操作簡單、出苗快的特點。本發(fā)明繁殖所用的外植體均來自于田間甘草嫩枝發(fā)育而來的腋芽和頂芽，只用1種培養(yǎng)基，省略一般再生芽需生根誘導(dǎo)后才能移苗所需要的不同培養(yǎng)基和時間，而且無菌苗成活高，無菌苗生根誘導(dǎo)率為100 %，40天就能出苗，50天后可移栽大田，移栽大田成活率為80 %以上。而且該方法可適用于多個甘草種的多個優(yōu)良株系的快速繁殖，該技術(shù)在甘草可持續(xù)發(fā)展中具有顯著的生態(tài)、經(jīng)濟和社會效益意義。
【附圖說明】
[0020]圖1為培養(yǎng)烏拉爾甘草嫩枝腋芽獲得的無菌苗。
[0021]圖2為無菌苗被切成帶有頂芽、腋芽外植體接種新培養(yǎng)基后伸長生長為繼代增殖的無菌苗。其中，a為頂芽外植體，b為帶有1個腋芽的莖段外植體，c為基部帶有1個腋芽和根的外植體；d、e、f分別對應(yīng)為由a、b、c的外植體伸長生長得到的繼代增殖的無菌苗。