番紅1號西紅花的脫毒試管球莖的培養(yǎng)法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及西紅花脫毒試管球莖的組織培養(yǎng)法。
【背景技術(shù)】
[0002] 西紅花（CrocussativusL.)又名番紅花、藏紅花，為鸞尾科番紅花屬的多年生植 物，是一味傳統(tǒng)名貴中藥材，同時享有世界上"最貴藥用植物"、"最好染料"和"最高檔香料" 之美譽，具有重要的經(jīng)濟價值。中國藥典2010年版（一部）記載西紅花味甘、性平、歸心、 肝經(jīng)；能活血化瘀，涼血，解毒，解郁安神；用于經(jīng)閉癥瘕，產(chǎn)后瘀阻，溫毒發(fā)斑，憂郁痞悶， 驚悸發(fā)狂等疾病。近年來還發(fā)現(xiàn)西紅花素具有抗癌效果。
[0003] 西紅花僅以柱頭入藥，野生資源有限，浙江建德為主要栽培產(chǎn)地之一，長期以來一 直采用球莖繁育的無性繁殖方法進行繁殖，繁殖系數(shù)低，年繁殖率一般為1. 5~2倍，阻 礙了良種推廣。此外因多年種植，球莖病毒病感染嚴(yán)重，主要為蠶豆黃花葉病毒?。˙ean yellowmosaicvirus,BYMV)，導(dǎo)致西紅花品質(zhì)材種質(zhì)退化、品質(zhì)下降，這些因素嚴(yán)重影響 了西紅花藥材產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種西紅花脫毒試管球莖的組織培養(yǎng)法，采用該 方法能獲得大量的西紅花脫毒組培種球。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種番紅1號西紅花的脫毒試管球莖的培養(yǎng) 法，依次包括以下步驟：
[0006]1)、將無病斑、無蟲癭且健壯飽滿的西紅花球莖于55~65°C的溫水浸泡后進行水 培催芽；培養(yǎng)條件為26~28°C、暗培養(yǎng)；
[0007] 2)、待球莖的側(cè)芽芽眼萌發(fā)且長成高度多0. 5cm時，抹下整個側(cè)芽，將上述側(cè)芽消 毒（常規(guī)消毒）后，切取其基部（即，從基部開始切?。┅? 2cm~0.5cm接種到生長培養(yǎng)基 上進行培養(yǎng)，從而獲得無菌苗；培養(yǎng)條件為：16小時光照，光照強度30~40μmolm2 ·s\ 溫度為27±1°C;8小時暗培養(yǎng)，溫度為21±1°C;上述光照和暗培養(yǎng)交替進行；
[0008]3)、待上述無菌苗長至1. 0~1. 2cm高時，剝?nèi)o菌苗上的3mm~5mm莖尖分生組 織，將莖尖分生組織接種到生長培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，從而獲得莖尖分生組織誘導(dǎo)的苗；培養(yǎng) 條件為：16小時光照，光照強度30~40μπιο?m2 ·s\溫度為27±1°C;8小時暗培養(yǎng)，溫 度為21 土 1°C;上述光照和暗培養(yǎng)交替進行；
[0009] 4)、待上述莖尖分生組織誘導(dǎo)的苗長到1.5cm~2.0cm高時作為植株I;切取植株 I上葉片，提取汁液，進行菜豆黃花葉病毒（Beanyellowmosaicvirus,BYMV)顆粒檢測；
[0010] 如果沒有檢測到病毒顆粒，則進入下述步驟5);
[0011] 如果檢測到病毒顆粒，從該植株I上剝?nèi)?mm~5mm莖尖分生組織，以此替代步驟 3)中的剝?nèi)∽詿o菌苗上的3mm~5mm莖尖分生組織重復(fù)上述步驟3)，直至獲得不含菜豆黃 花葉病毒顆粒的植株I為止；
[0012] 5)、將步驟4)所得的不含菜豆黃花葉病毒顆粒的植株I接種到誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng) 基上進行培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為：16小時光照，光照強度30~40μπι〇1m2*s\溫度為27±1°C; 8小時暗培養(yǎng)，溫度為21 ± 1°C;上述光照和暗培養(yǎng)交替進行；
[0013] 6)、待從植株I上誘導(dǎo)出的叢生芽長到1. 0~1. 5cm高時，割取2~3株作為叢生 植株II;將上述叢生植株II接種到增殖培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為：16小時光照，光照 強度30~40以111〇1111 2*81，溫度為27±1°(：;8小時暗培養(yǎng)，溫度為21±1°(：;上述光照和 暗培養(yǎng)交替進行；
[0014] 7)、待上述植株II長出的叢生芽長到1.0~2.0cm尚，割取1~3株作為植株III;將 此植株III接種到球莖誘導(dǎo)膨大培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，直至長成所需的規(guī)格；生長條件為：16 小時光照，光照強度10~30μmolm2.s\溫度為27± 1°C;8小時暗培養(yǎng)，溫度為21 ± 1°C; 上述光照和暗培養(yǎng)交替進行。
[0015] 備注說明：上述"所需的規(guī)格"一般是指球莖直徑達到彡1cm。
[0016] 作為本發(fā)明的番紅1號西紅花的脫毒試管球莖的培養(yǎng)法的改進：所述步驟1)為將 無病斑、無蟲癭且健壯飽滿的西紅花球莖于55~65°C的溫水中浸泡25~35min(較佳為 30min)，隨后室溫晾干至球莖表面無水滴，再放入55~65°C的溫水中進行浸泡；重復(fù)上述 晾干、浸泡1~3次后再進行水培催芽。
[0017] 作為本發(fā)明的番紅1號西紅花的脫毒試管球莖的培養(yǎng)法的進一步改進：
[0018] 所述步驟2)和步驟3)中的生長培養(yǎng)基為：MS基本培養(yǎng)基+白砂糖20~30g/L+ 瓊脂4~6g/L，pH為5. 8~6. 0。
[0019] 上述生長培養(yǎng)基的制作方法具體如下：以MS基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別加入白砂 糖、瓊脂均勻混合，利用lmol/L的Κ0Η或lmol/L的HC1調(diào)節(jié)pH至5. 8~6. 0 ;每1L的MS 基本培養(yǎng)基中加20~30g糖、4~6g瓊脂。
[0020] 作為本發(fā)明的番紅1號西紅花的脫毒試管球莖的培養(yǎng)法的進一步改進：
[0021] 所述步驟5)中的誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基為：MS基本培養(yǎng)基+0. 2~0. 5mg/lN-苯 基-N'-l，2, 3-噻二唑-5 脲（TDZ)+0. 1 ~0· 5mg/l萘乙酸（NAA)+ 白砂糖 20 ~30g/L+ 瓊 脂 4 ~6g/L，pH為 5. 8 ~6.0。
[0022] 上述誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基的制作方法具體如下：以MS基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別加入 TDZ、NAA、白砂糖和瓊脂，均勻混合，利用lmol/L的Κ0Η或lmol/L的HC1調(diào)節(jié)pH為5. 8~ 6. 0 ;每1L的培養(yǎng)基加入0· 2~0· 5mgTDZ、0. 1~0· 5mgNAA、20~30g白砂糖、4~6g瓊 脂。
[0023] 作為本發(fā)明的番紅1號西紅花的脫毒試管球莖的培養(yǎng)法的進一步改進：
[0024] 所述步驟6)中的增殖培養(yǎng)基為：MS基本培養(yǎng)基+0. 3~2. 0mg/l(較佳為1.Omg/ 1)6-芐基腺嘌呤（6-ΒΑ)+(λ05~(λlmg/1萘乙酸（NAA)+20~30g/L白砂糖+4~6g/L瓊 月旨，pH為5. 8~6. 0。
[0025] 上述增殖培養(yǎng)基的制作方法具體如下：以MS基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別加入6-BA、 NAA、白砂糖和瓊脂，均勻混合，利用lmol/L的Κ0Η或lmol/L的HC1調(diào)節(jié)pH為5. 8~6. 0 ; 每1L的培養(yǎng)基加入0· 3~2.Omg(較佳為1. 0mg)6_BA、0· 05~0·lmgNAA、20~30g白砂 糖、4~6g瓊脂。
[0026] 作為本發(fā)明的番紅1號西紅花的脫毒試管球莖的培養(yǎng)法的進一步改進：
[0027] 步驟7)中的球莖誘導(dǎo)膨大培養(yǎng)基：MS基本培養(yǎng)基+3. 0~5.Omg/1 6-芐基腺嘌 呤（6-BA)+ 白砂糖 60 ~80g/L+170 ~340mg/l(較佳為 200mg/l)KH2P04、l~L5g/l活性 炭、瓊脂4~9g/L，pH為5. 5~6. 0。
[0028] 上述球莖誘導(dǎo)膨大培養(yǎng)基的制作方法具體如下：以MS基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別加 入6-BA、白砂糖、ΚΗ2Ρ04、活性炭、瓊脂，利用lmol/L的Κ0Η或lmol/L的HC1調(diào)節(jié)pH為5. 8~ 6. 0 ;每1L的MS基本培養(yǎng)基中加3. 0~5.Omg6-BA、60~80g白砂糖、170~340mg(較佳 為200mg)KH2P04、1~1. 5g活性炭和4~9g瓊脂。
[0029] 作為本發(fā)明的番紅1號西紅花的脫毒試管球莖的培養(yǎng)法的進一步改進：所述步驟 4)中，切取植株I上0. 8~1. 2cm(較佳為lcm左右）葉片，提取汁液。
[0030] 備注說明：葉片過小汁液提取不夠，影響電鏡觀察；葉片過大，那需要延長培養(yǎng)時 間，成本增加。
[0031] 在本發(fā)明的步驟2)中，抹下整個側(cè)芽，是指輕輕搖動側(cè)芽，連基部掰下。側(cè)芽的消 毒方式為常規(guī)消毒，即，將側(cè)芽在濃度為10%的次氯酸鈣溶液中浸泡15分鐘，然后用無菌 水沖洗5-6次。
[0032] 步驟4)中的"菜豆黃花葉病毒（Beanyellowmosaicvirus,BYMV)顆粒檢測"為 常規(guī)技術(shù)，例如可依據(jù)已經(jīng)公開發(fā)表于《中草藥》雜志的《藏紅花病毒病原的分子鑒定》進 行檢測。
[0033] 本發(fā)明的技術(shù)改進點主要體現(xiàn)在以下方面：
[0034] 1、本發(fā)明前期的研究確定侵染番紅1號的主要病毒病是菜豆黃花葉病毒（Bean yellowmosaicvirus,BYMV)，為了有效脫除BYMV，根據(jù)該病毒特征，本發(fā)明采用了 55~ 65°C的溫水浸泡西紅花球莖的方式進行預(yù)處理，結(jié)合莖尖分生組織剝離法，結(jié)果表明采用 溫水浸泡預(yù)處理，可以有效的降低BYMV的濃度，提高脫毒率。而水溫過高會導(dǎo)致球莖側(cè)芽 燙傷，嚴(yán)重影響側(cè)芽的萌發(fā)，而水溫過低會導(dǎo)致西紅花球莖內(nèi)的菜豆黃花葉病毒鈍化不徹 底。
[0035] 2、本發(fā)明采用水培催芽，抹下整個側(cè)芽作為外植體，結(jié)果表明水培方式得到的側(cè) 芽感染外界病原菌數(shù)量和種類都大大減少，大大提高了無菌苗的獲得；此外，采用生產(chǎn)上廢 棄的側(cè)芽，不僅為獲得大量無菌苗和試管球莖提供了物質(zhì)保障，而且大大節(jié)省了成本。
[0036] 3、本發(fā)明采用添加了高濃度的白砂糖和ΚΗ2Ρ04的培養(yǎng)基來誘導(dǎo)和膨大西紅花球 莖。高濃度的白砂糖可以有效的提高C源和能量，促進球莖的形成；豐富的K肥可以加速球 莖的生長。
[0037] 本發(fā)明的番紅1號西紅花的脫毒試管球莖的培養(yǎng)法，屬于一種誘導(dǎo)西紅花脫毒試 管球莖的組織培養(yǎng)方法。依照植物組織培養(yǎng)中細胞全能性的原理，可以在短時間內(nèi)生產(chǎn)大 量遺傳背景相同、長勢一致的優(yōu)質(zhì)脫毒健康種苗（種子），而且依靠實驗室可以實現(xiàn)周年的 長期提供優(yōu)質(zhì)種苗。在本發(fā)明的方法中，將長勢健壯且無病蟲害的西紅花球莖先進行催芽， 有助于打破球莖休眠；將生產(chǎn)上掰下的廢棄的側(cè)芽作為外植體，為獲得大量無菌苗和試管 球莖提供了物質(zhì)保障；利用莖尖脫毒技術(shù)生產(chǎn)西紅花脫毒球莖，有助于提高西紅花種球的 品質(zhì)，提升花絲的產(chǎn)量和質(zhì)量。所以，本發(fā)明的西紅花球莖的組織培養(yǎng)法，是一種不受季節(jié) 等因素影響，高效、快速提供優(yōu)質(zhì)西紅花種苗的方法，可以加速良種推廣速度，提高田間品 種種植產(chǎn)量。
[0038] 綜上所述，本發(fā)明建立的西紅花脫毒試管球莖組織培養(yǎng)體系將為良種（西紅花） 工廠化育苗提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。
【具體實施方式】
[0039]實施例1、一種西紅花試管球莖的組織培養(yǎng)法，依次進行以下步驟：
[0040]1)、將無病斑、無蟲癭且健壯飽滿的西紅花球莖在水溫為55~65°C的溫水中浸 泡30min，隨后晾干（即，室溫下放置直至西紅花球莖表面無明顯水滴為止），再放入55~ 65°C的溫水中進行浸泡；重復(fù)上述晾干、浸泡2次后進行水培催芽；培養(yǎng)條件為：26~28°C 暗培養(yǎng)；
[0041]2)、待球莖的側(cè)芽芽眼萌發(fā)且長成高度多0. 5cm時，輕輕搖動側(cè)芽，連基部抹下 整個側(cè)芽，將上述側(cè)芽常規(guī)消毒后，切取基部〇. 2cm~0. 5cm接種到生長培養(yǎng)基上進行培 養(yǎng)，從而獲得無菌苗；培養(yǎng)條件為：16小時光照，光照強度30~40μmolm2 ·s\溫度為 27±1°C;8小時暗培養(yǎng)，溫度為21±1°C;上述光照和暗培養(yǎng)交替進行；
[0042] 生長培養(yǎng)基為：MS基本培養(yǎng)基+白砂糖30g/L+瓊脂6g/L，pH為5. 8~6. 0。
[0043]3)、待上述無菌苗長至1. 0~1. 2cm高時，剝?nèi)o菌苗上的3mm~5mm莖尖分生組 織，接種到生長培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，從而獲得莖尖分生組織誘導(dǎo)的苗；培養(yǎng)條件為：16小時 光照，光照強度30~40μmolm2 ·s\溫度為27 ± 1°C;8小時暗培養(yǎng)，溫度為21 ± 1°C;上 述光照和暗培養(yǎng)交替進行；
[0044] 生長培養(yǎng)基為：MS基本培養(yǎng)基+白砂糖30g/L+瓊脂6g/L，pH為5