一種黑果菝葜初代誘導及離體保存的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種植物初代誘導及離體保存的方法，特別是一種黑果菝葜初代誘導及離體保存的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]黑果菝葜(Smilax glauco-china ffarb.)又名金剛藤頭，為百合科(Liliacea)菝葜屬(Smilax L.)攀援灌木，根、莖入藥，其味甘，性平，具有祛風，清熱，利濕，解毒的功效。根狀莖粗短且富含淀粉，可以用于制做糕點、釀酒或加工食用。春、夏季采收的嫩葉可鮮用，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸和多種維生素，而且具有清熱解毒的藥膳功效，為不可多得的藥食兩用的植物。
[0003]黑果菝葜主要分布于我國的甘肅(南部)、陜西(秦嶺以南)、山西(南部)、河南、四川(東部)、貴州、湖北、湖南、江蘇(南部)、浙江、安徽、江西、廣東(北部)和廣西(東北部)等地，生于海拔1600m以下的林下、灌叢或山坡上。黑果菝葜的繁育特性主要是靠自然分蘗或?qū)嵣敝?，但每株的年分蘗能力低，研究發(fā)現(xiàn)百合科的種子休眠期長且發(fā)芽率低，扦插和嫁接比較難成活。近幾年來，由于人們的過度的采挖，該植物資源面臨更嚴峻的境況。鑒于黑果菝葜良好的藥用價值和面臨的資源困境，為了更好的開發(fā)和保護黑果菝葜中藥資源，本發(fā)明對黑果菝葜優(yōu)良植株初代誘導和離體保存進行了探討和研究，將有利于該野生資源的保護和優(yōu)良性狀的保持，為進一步綜合開發(fā)黑果菝葜創(chuàng)造條件。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種黑果菝葜初代誘導及離體保存的方法，通過對黑果菝葜進行外植體消毒誘導、增殖、生根及離體保存試驗，篩選出最佳外植體消毒方法、適宜離體保存的生長調(diào)節(jié)劑及濃度。它能夠提高初代誘導率，延長繼代周期，減少工作量和成本，保證無菌苗的優(yōu)良性狀。
[0005]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案達到上述目的:一種黑果菝葜初代誘導及離體保存的方法，包括以下步驟:
[0006](1)外植體的消毒:將3?5滴洗潔精滴入裝有100ml自來水的燒杯中，取無病蟲害黑果菝葜當年生的幼嫩帶芽莖段剪切成4cm長的帶芽莖段，置于燒杯中攪拌，再用軟毛刷擦拭表面污垢，流水沖洗15min，然后在超凈工作臺內(nèi)用75v/v%的乙醇消毒15S，無菌水沖洗1次，再用0.lv/v% HgCl2消毒lOmin，無菌水浸泡3次，每次約2min，用無菌濾紙吸干外植體表面水分，獲得外植體，其中無菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌的蒸餾水；
[0007](2)無菌芽的誘導:將步驟(1)得到的外植體剪切成1?1.5cm的帶芽莖段，接種于MS啟動培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±3°C，光照強度20?30 ymol/m2.s，光照時間為12h/d的條件下進行暗培養(yǎng)10d開始萌發(fā)，發(fā)育成不定芽，所述MS啟動培養(yǎng)基是以MS為基本培養(yǎng)基，還加入0.5?2.5mg/L的6-芐基腺嘌呤6_BA、0?1.0mg/L的吲哚丁酸IBA和0?2.0mg/L萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8 ;
[0008](3)無菌芽的繼代增殖:將步驟(2)中得到的不定芽剪切成1?2cm長的單芽或芽叢接種于MS繼代增殖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±3°C，光照強度20?30 ymol/m2.s，光照時間為12h/d的條件下培養(yǎng)30?40d便長出更多的芽叢，所述繼代增殖培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基，添加0.1?3.0mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.5?2.5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0.1?2.0mg/L的吲哚乙酸IBA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8 ;
[0009](4)無菌苗的生根:將步驟(3)中得到的芽叢剪切為單芽置于1/2MS生根培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±3°C，光照強度20?30ymol/m2.s，光照時間為12h/d的條件下進行生根培養(yǎng)15?20d獲得生根苗，所述1/2MS生根培養(yǎng)基是以1/2MS為基本培養(yǎng)基，還加入0?1.0mg/L的萘乙酸ΝΑΑ、0?1.0mg/L的吲哚丁酸IBA，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為 5.8 ;
[0010](5)無菌苗的保存:將步驟⑷中得到的生根苗置于離體保存培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±3°C，光照強度20?30 μπιο?/m2 *s，光照時間為12h/d的條件下進行離體保存，所述離體保存培養(yǎng)基是以MS為基本培養(yǎng)基，還加入0.05?0.5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0.05?0.lmg/L的萘乙酸ΝΑΑ、0.5?2.0mg/L的PP333，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8。
[0011]本發(fā)明的突出優(yōu)點在于:
[0012](1)本發(fā)明采用生物技術(shù)方法實現(xiàn)了黑果菝葜的初代誘導出芽及長期保存。該方法使無菌苗誘導率和存活率高，生長健壯，繼代周期延長，減少工作量和成本，保證無菌苗種質(zhì)的優(yōu)良性和遺傳穩(wěn)定性。
[0013](2)所用試劑升汞、酒精，MS基本培養(yǎng)基和6-芐基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA、噻重氮苯基脲TDZ、吲哚丁酸IBA，價格低廉，試驗成本低。
[0014](3)采用本發(fā)明所述的初代誘導及保存的方法，暗培養(yǎng)10d開始長出新芽，培養(yǎng)30d，芽誘導率達78.5 %，繼代培養(yǎng)50d即可成苗，生根培養(yǎng)30d生根率為82.5%，在離體保存培養(yǎng)基上保存180d后，存活率最高為80.7%。
【具體實施方式】
[0015]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進一步說明。
[0016]實施例1
[0017](1)外植體的消毒:將3?5滴洗潔精滴入裝有100ml自來水的燒杯中，取無病蟲害黑果菝葜當年生的幼嫩帶芽莖段剪切成4cm長的帶芽莖段，置于燒杯中攪拌，再用軟毛刷擦拭表面污垢，流水沖洗15min，然后在超凈工作臺內(nèi)用75v/v%的乙醇消毒15S，無菌水沖洗1次，再用0.lv/v% HgCl2消毒lOmin，無菌水浸泡3次，每次約2min，用無菌濾紙吸干外植體表面水分，獲得外植體，其中無菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌的蒸餾水；
[0018](2)無菌芽的誘導:將步驟(1)得到的外植體剪切成1?1.5cm的帶芽莖段，接種于MS啟動培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度25±3°C，光照強度20?30 μπιο?/m2 *s，光照時間為12h/d的條件下進行暗培養(yǎng)12d開始萌發(fā)，發(fā)育成不定芽。所述MS啟動培養(yǎng)基是以MS為基本培養(yǎng)基，還加入0.5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊月旨，培養(yǎng)基的pH值為5.8，誘導培養(yǎng)30d，出芽率為74.8% ;
[0019](3)無菌芽的繼代增殖:將步驟(2)中得到的不定芽剪切成1?2cm長的單芽或芽叢接種于MS繼代增殖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±3°C，光照強度20?30 ymol/m2.s，光照時間為12h/d的條件下培養(yǎng)30?40d便長更多的芽叢。所述MS繼代增殖培養(yǎng)基中添加0.lmg/L的噻重氮苯基脲TDZ、2.5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、1.0mg/L的吲哚乙酸IBA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，培養(yǎng)30d，增殖系數(shù)為2.6 ;
[0020](4)無菌苗的生根:將步驟(3)中得到的芽叢剪切為單芽置于1/2MS生根培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±3°C，光照強度20?30ymol/m2.s，光照時間為12h/d的條件下進行生根培養(yǎng)15?20d可獲得生根苗。所述1/2MS生根培養(yǎng)基中添加0.5mg/L的吲哚丁酸IBA，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，培養(yǎng)30d，生根率為65.3% ；
[0021](5)無菌苗的保存:將步驟⑷中得到的生根苗置于離體保存培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±3°C，光照強度20?30 μπιο?/m2 *s，光照時間為12h/d的條件下進行離體保存，所述離體保存培養(yǎng)基是以MS為基本培養(yǎng)基，還加入0.5mg/L的6-芐基腺嘌呤6_BA、0.lmg/L的萘乙酸ΝΑΑ、0.5mg/L的PP333，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，保存180d，存活率為68.4%。
[0022]實施例2
[0023](1)外植體的消毒:將3?5滴洗潔精滴入裝有100ml自來水的燒杯中，取無病蟲害黑果菝葜當年生的幼嫩帶芽莖段剪切成4cm長的帶芽莖段，置于燒杯中攪拌，再用軟毛刷擦拭表面污垢，流水沖洗15min，然后在超凈工作臺內(nèi)用體積百分比為75￥八％的乙醇消毒15S，無菌水沖洗1次，再用0.lv/v% HgCl2消毒lOmin，無菌水浸泡3次，每次約2min，用無菌濾紙吸干外植體表面水分，獲得外植體，其中無菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌的蒸餾水；
[0024](2)無菌芽的誘導:將步驟⑴得到的外植體剪切成1?1.5cm的帶芽莖段，接種于MS啟動培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度25±3°C，光照強度20?30 ymol/m2 *s，光照時間為12h/d的條件下進行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)10d開始萌發(fā)，發(fā)育成不定芽。所述MS啟動培養(yǎng)基是以MS為基本培養(yǎng)基，還加入1.5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0.lmg/L的吲哚丁酸IBA和0.2mg/L萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，誘導培養(yǎng)30d，出芽率為78.5%;
[0025](3)無菌芽的繼代增殖:將步驟(2)中得到的不定芽剪切成1?2cm長的單芽或芽叢接種于MS繼代增殖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±3°C，光照強度20?30 ymol/m2.s，光照時間為12h/d的條件下培養(yǎng)30?40d便長更多的芽叢。所述繼代增殖培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基，添加1.0mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、1.5mg/L的6-芐基腺嘌呤6_BA、2.0mg/L的吲哚乙酸IBA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，培養(yǎng)30d,增殖系數(shù)為3.2 ;
[0026](4)無菌苗的生根:將步驟(3)中得到的芽叢剪切為單芽置于1/2MS生根培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±3°C