一種提高銀杏類黃酮含量的方法及金雀異黃素的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)科技技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種提高銀杏類黃酮含量的方法及金雀 異黃素的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 銀杏(Ginkgo biloba L.)原產(chǎn)我國，銀杏科銀杏屬，落葉喬木，雌雄異株，又稱白 果樹、公孫樹。銀杏是目前世界上最古老的孑遺植物，有著"活化石"之稱?？茖W(xué)家早在上世 紀(jì)70年代已研究證明銀杏葉提取物對(duì)心腦血管疾病非常好的治療效果，自此銀杏的藥用價(jià) 值被人們廣泛關(guān)注，如今銀杏已經(jīng)成為國際藥用植物研究開發(fā)的熱點(diǎn)之一。其中銀杏類黃 酮化合物是治療老年性癡呆癥的首選天然藥物，對(duì)高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、心血管 疾病等也有十分顯著的治療效果。此外，黃酮類化合物廣泛分布于植物界，具有很多的生物 學(xué)功能，如調(diào)節(jié)植物生長，保護(hù)植物免受紫外線，抗氧化活性，抗衰老，抵御致病菌侵襲，影 響植物的生殖力和花粉的萌發(fā)。雖然銀杏類黃酮類化合物具有重要的藥理和生理活性，但 是在銀杏體內(nèi)含量低，不易提取，所以提高銀杏葉類黃酮含量從而提高銀杏的抗性已經(jīng)成 為研究重點(diǎn)。
[0003]金雀異黃素(Genistein，GNT)又稱為染料木黃酮或染料木素，是一種大豆體內(nèi)天 然存在的異黃酮類物質(zhì)，還是酪氨酸蛋白激酶的抑制劑，被用來研究細(xì)胞G蛋白信號(hào)的轉(zhuǎn) 導(dǎo)。金雀異黃酮及其糖苷具有弱雌激素樣活性，具有良好的抗癌、抗氧化和抑制過氧化氫生 成、預(yù)防中老年骨質(zhì)疏松癥、改善女性更年期綜合癥和心血管疾病、增加抗氧化酶活性等作 用，廣泛用作營養(yǎng)食品補(bǔ)充劑。
[0004] 近年來眾多研究表明GNT可以促進(jìn)畜禽類的生長，提高泌乳或產(chǎn)蛋性能，提高繁殖 力和增強(qiáng)機(jī)體免疫力，可以促進(jìn)蟠桃果實(shí)著色，提高蟠桃糖酸比，促進(jìn)蘋果果實(shí)著色和桃果 實(shí)著色，增加葡萄果實(shí)花青苷積累等。但是對(duì)于GNT在植物類黃酮方面的研究，未有任何相 關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明提供了一種提高銀杏類黃酮含量的方法及金雀異黃素的應(yīng)用， 解決了銀杏葉片類黃酮含量極低的問題，提供了一種操作簡便，成本低，可以高效提高銀杏 類黃酮含量方法。
[0006] 本發(fā)明第一方面提供了一種提高銀杏類黃酮含量的方法，其步驟包括：用金雀異 黃素處理銀杏。
[0007] 本發(fā)明第二方面提供了金雀異黃素在提高植物類黃酮含量中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的有益效果是:①本發(fā)明通過對(duì)銀杏施加金雀異黃素，改變了銀杏體內(nèi)生 理代謝水平，促進(jìn)銀杏光合作用，從而促進(jìn)類黃酮積累，提高銀杏類黃酮含量，提高銀杏的 藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，且操作簡便，成本低廉。
[0009] ②經(jīng)金雀異黃素處理的葉片，類黃酮、花青素含量、可溶性糖含量、葉綠素含量顯 著提高，抗氧化酶活性、苯丙氨酸解氨酶、查爾酮合成酶及查爾酮異構(gòu)酶活性明顯增強(qiáng)，因 此不僅提高類黃酮含量，還大大提高了植物的抗性，從而提高植物產(chǎn)量和品質(zhì)，具有良好的 推廣應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0010]本發(fā)明第一方面提供了一種提高銀杏類黃酮含量的方法，其步驟包括：用金雀異 黃素處理銀杏。對(duì)銀杏施加金雀異黃素，改變了銀杏體內(nèi)生理代謝水平、促進(jìn)銀杏光合作 用，從而促進(jìn)類黃酮積累，提高銀杏類黃酮含量，且植物的花青素含量、可溶性糖含量、葉綠 素含量顯著提高，抗氧化酶活性、苯丙氨酸解氨酶、查爾酮合成酶及查爾酮異構(gòu)酶活性明顯 增強(qiáng)。
[0011]優(yōu)選的，所述金雀異黃素配制為金雀異黃素的水溶液后處理銀杏，所述金雀異黃 素濃度為50-150ymol/L。一定范圍內(nèi)隨著噴施金雀異黃素濃度的增高，銀杏葉片中的類黃 酮含量呈上升趨勢(shì)，而銀杏葉花青素、苯丙氨酸解氨酶含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，50-150ymol/L的濃度范圍內(nèi)各個(gè)參數(shù)均較佳，更加有利于銀杏光合作用及體內(nèi)生理代謝。
[0012] 更加優(yōu)選的，所述金雀異黃素水溶液中含有增溶劑。所述增溶劑可增加金雀異黃 素在水溶液中的溶解度，分散更加均勻，有利于植物對(duì)金雀異黃素的吸收。
[0013] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述增溶劑為吐溫，所述吐溫占金雀異黃素水溶液的體積百分比 為0.05-0.2% 〇
[0014] 優(yōu)選的，所述處理的方法為在銀杏發(fā)芽一個(gè)月后將金雀異黃素噴布于銀杏葉片表 面。施用金雀異黃素的最佳時(shí)機(jī)為銀杏發(fā)芽一個(gè)月后，此時(shí)對(duì)銀杏作用的效果更加顯著。
[0015] 更加優(yōu)選的，所述金雀異黃素的用量為1-5μπι〇1。
[0016] 本發(fā)明第二方面提供了金雀異黃素在提高植物類黃酮含量中的應(yīng)用。
[0017] 優(yōu)選的，所述植物為銀杏。
[0018] 更加優(yōu)選的，所述應(yīng)用的步驟包括:在銀杏發(fā)芽一個(gè)月后，將金雀異黃素配制為金 雀異黃素的水溶液后噴布于銀杏葉片表面，所述金雀異黃素濃度為50-150ymol/L，所述金 雀異黃素水溶液中含體積百分比為〇. 05-0.2 %的吐溫。
[0019] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的一種提高銀杏類黃酮含量的方法及金雀異黃 素的應(yīng)用予以進(jìn)一步說明。
[0020] 實(shí)施例1
[0021] 1測試方法
[0022] 本實(shí)施例中各測定方法如下，實(shí)施案例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī) 條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0023] 1.1銀杏葉綠素含量測定
[0024]按照下列方法進(jìn)行葉綠素 a，葉綠素 b含量的測定。取3g鮮葉、打孔取樣、研磨、加入 80%丙酮浸提，定容后在663nm和645nm波長下測量，根據(jù)C(mg · L-4 = 20.31 OD 645+8.04 00 663，（00為分光值)計(jì)算葉綠素濃度。最后用公式:￥〇1^(11^2)=[濃度(11^「 1)\提取 液總量(mL)/[葉面積(dm2) X 100]換算成葉綠素含量。進(jìn)行3次重復(fù)測定，取平均值。
[0025] 1.2花青素含量的測定
[0026] 利用分光光度法對(duì)葉片花青素的含量進(jìn)行測定，進(jìn)行3次重復(fù)測定，取平均值。
[0027] 1.3銀杏可溶性糖含量的測定
[0028]采用蒽酮比色法測定可溶性糖，四組處理分別稱量IOg銀杏葉烘干，取Ig烘干后的 葉片用IOml乙醇溶液研磨成勻漿，靜置30min后，4500rpm離心15min，取上清液3ml到25ml容 量瓶加水定容。然后取Iml稀釋液加入5ml蒽酮試劑，煮沸l(wèi)Omin，冷卻后在620nm測定吸光 值。
[0029] 1.4銀杏苯丙氨酸解氨酶活性的測定
[0030] 用紫外分光光度法測定銀杏苯丙氨酸解氨酶活性，取2.Og新鮮銀杏葉片，加入3ml 硼酸緩沖液和〇. 5g PVP，研磨，10 OOOrpm離心15min，取上清。取O . 5mL苯丙氨酸溶液加入 0.5ml上清液。然后加入IOml蒸餾水，在40°C的水浴中加熱30min，再在沸水中煮5min終止反 應(yīng)，在290nm下測定分光光度值，以吸收變化0.01所需酶量作為一個(gè)酶活性單位(U)。進(jìn)行3 次重復(fù)測定，取平均值。
[0031] 1.5銀杏類黃酮含量的測定
[0032]紫外分光光度法測定提取物中總黃酮含量，稱取銀杏鮮葉I . 0 g后烘干，加 10ml70 %乙醇浸泡、抽濾，重復(fù)三次。合并濾液，定容至50ml待測。吸取5ml 100ug/L蘆丁溶 液、30%乙醇 10ml、0.7ml 5%NaN〇2、混勻后加入0.7ml 10%AlCl3(35min后加5ml 40%Na0H， 30%乙醇定容25ml。35°(3水浴IOmin后，510nm波長測定吸光度。以蘆丁為標(biāo)樣，類黃酮含量 以百分比表示。
[0033] 1.6銀杏抗氧化酶活性的測定
[0034]采用氮藍(lán)四唑法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性，以抑制NBT光化學(xué)還原的50 %為 一個(gè)酶活性單位(U);采用愈創(chuàng)木酚顯色法測定過氧化物酶(POD)活性，以每分鐘內(nèi)470nm下 的光密度(D470nm)變化0.1為一個(gè)酶活性單位(U);
[0035]采用紫外吸收法測定過氧化氫酶(CAT)活性，以Imin內(nèi)A24q降低0.1為一個(gè)酶活性 單位(U);利用APX在H2O2存在的條件下使抗壞血酸量減少的原理測定酶活性，紫外一可見分 光光度計(jì)上讀取290nm處吸光光度值在3分鐘內(nèi)每15秒中的變化。計(jì)算每分鐘內(nèi)每毫克蛋白 轉(zhuǎn)化的抗壞血酸量，為一個(gè)酶活性單位(U)。
[0036] 2實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果
[0037] 2.1實(shí)驗(yàn)過程
[0038] 1)植物材料的獲得
[0039] 本發(fā)明的試驗(yàn)材料為1年生銀杏實(shí)生苗，品種為"家佛手"。栽培基質(zhì)為河沙與腐殖 土按1:2配比混合基質(zhì)，花盆(直徑25cm，高35cm)，每盆一株，置于溫室中，光照12h/d，相對(duì) 濕度60-70%。每周每盆用100mL的液體化肥(含有0.36g N，0.12g P，0.14g K)澆灌。
[0040] 2)實(shí)驗(yàn)處理
[0041 ] 本發(fā)明在銀杏苗長出四個(gè)葉片時(shí)，設(shè)置0(對(duì)照組），50，100和150μπιο 1/L四個(gè)濃度 梯度的GNT水溶液，且水溶液中含有體積比為0.1 %的吐溫。噴灑銀杏苗，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)小 區(qū)，每個(gè)小區(qū)設(shè)3次重復(fù)，共選取長勢(shì)相同的36株銀杏苗。每月一次，每次20ml，連續(xù)噴灑三 月。噴施的時(shí)候，所有葉片及其正反面都要噴到。GNT處理完4周后開始采樣測試。
[0042] 2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0043] 2.2. IGNT對(duì)葉綠素含量的影響
[0044]采用本實(shí)施例1.1部分所述測試步驟，測得的GNT對(duì)葉綠素含量的影響結(jié)果見表1。
[0045]表1 GNT對(duì)銀杏葉葉綠素含量的影響
[0047] 注：同一列中不同字母代表在p〈5%水平上差異顯著。
[0048] 由表1所示，100、150ymol/L GNT處理均能提高葉綠素 a、葉綠素 b的含量。100μ mol/ L GNT處理的葉綠素 a、葉綠素 b含量均為最高值，分別為1.386、0.647mg/g FW，分別顯著高 于對(duì)照組45.58%、34.51 %，且P〈0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。葉綠素 a+b的變化幅度與葉綠素 a、 葉綠素 b的含量的變化一致。葉綠素 a/b的含量均大于1，且無顯著性差異。
[0049] 2.2.2 GNT對(duì)可溶性糖含量的的影響
[0050]采用本實(shí)施例1.3部分所述測試步驟，測得的GNT對(duì)可溶性糖含量的影響結(jié)果見表 2〇
[0051 ]表2 GNT對(duì)銀杏葉可溶性糖、可滴定算含量的影響
[0053] 注：同一列中不同字母代表在p〈5 %水平上差異顯著。
[0054] 表2所示可溶性糖含量測定結(jié)果表明，50、100、150ymol/L GNT處理的可溶性糖含 量均高于對(duì)照組，比對(duì)照組分別高出：20.04%、10.11 %、15.27 %。表明噴施GNT對(duì)銀杏葉片 積累碳水化合物有一定的促進(jìn)作用。
[0055] 2.2.3 GNT對(duì)類黃酮含量及花青素含量的影響
[0056]采用本實(shí)施例1.2、1.5部分所述測試步驟，測得的GNT對(duì)類黃酮含量及花青