一種秋水仙素誘導楸葉泡桐同源四倍體的培育方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于林木生物技術育種領域，尤其涉及一種秋水仙素誘導楸葉泡桐同源四 倍體的培育方法。
【背景技術】
[0002] 泡桐)為玄參科泡桐屬植物，落葉喬木，現(xiàn)有9個種，2個變種，在我國 25個省(市)、自治區(qū)均有分布，是我國重要的速生用材林、防護林和平原綠化的主選樹種， 在改善生態(tài)環(huán)境和提高農民收入等方面起著重要作用。但泡桐生產中還存在著大冠低干和 叢枝病嚴重等問題，由于泡桐種質資源少，遺傳資源匱乏、滿足國民經濟建設要求的泡桐新 品種嚴重不足，影響了農民種植泡桐的積極性，極大阻礙了泡桐產業(yè)的發(fā)展。種種事實表 明，利用現(xiàn)代生物技術手段培育多倍體是解決目前泡桐新品種不足的有效途徑。
[0003] 多倍體植株具有生物量大，抗逆能力強等優(yōu)點。隨著組織培養(yǎng)和分子生物學的飛 速發(fā)展，國內外科技人員經過長期不懈的努力，已誘導出多個林木的多倍體，如楊樹等樹種 培育成了林木新品種在生產中得以推廣應用。對泡桐來說，二十世紀四十年代，日本學者利 用秋水仙素處理毛泡桐種子多倍體的研究工作，但沒有變異植株保存下來。二十世紀九十 年代，范國強等利用化學誘變結合組織培養(yǎng)技術分別對蘭考泡桐、白花泡桐、南方泡桐、豫 雜一號泡桐和毛泡桐等進行了四倍體誘導，創(chuàng)制了其新種質，經過大量地繁育和區(qū)試工作， 已獲得'毛四桐1號'、'蘭四桐1號'、'白四桐1號'、'南四桐1號'和'雜四桐1號'五個 國家植物新品種權，并且在林業(yè)生產中推廣應用，產生了顯著的經濟、社會和生態(tài)效益。但 由于楸葉泡桐葉片細胞內含物的種類和數(shù)量與其他泡桐存在一定差異，至今未見國內外有 關四倍體楸葉泡桐成功誘導的報道。楸葉泡桐是泡桐屬中材質較好的一種，利用秋水仙素 結合組織培養(yǎng)方法培育其四倍體，不僅對提高楸葉泡桐的生長速度，增強其抗逆性，克服目 前楸葉泡桐生產中存在的問題具有重要的實際意義，而且對擴大泡桐的遺傳背景、豐富其 種質資源也有一定的理論意義。此外，四倍體楸葉泡桐也是培育其三倍體的重要遺傳材料。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明針對目前泡桐研究和生產中存在的問題，提供一種操作簡單、方便高效、成 本低，誘導率高的楸葉泡桐同源四倍體的培育方法。
[0005] 本發(fā)明采用以下技術方案實現(xiàn)上述目的： 一種秋水仙素誘導楸葉泡桐同源四倍體的培育方法，該方法包括以下步驟：（1)葉片 預處理；（2)秋水仙素誘導處理；（3)芽誘導；（4)根誘導；（5)楸葉泡桐變異植株鑒定；（6) 四倍體楸葉泡桐幼苗的移栽。
[0006] 該方法具體步驟如下： (1)葉片預處理取楸葉泡桐靠近莖尖處的2~4對葉，將葉片剪成1. 0 X 1.0 cm2的 方形小塊，無菌條件下將其置于MS+0. 3 mg/LNAA+14 mg/L BA的固體培養(yǎng)基中，在溫度為 20±2°C的人工氣候箱內黑暗條件下處理4~8d ; (2) 秋水仙素誘導處理無菌條件下將經過步驟（1)預處理后的楸葉泡桐葉片置于含 15~45 mg/L秋水仙素和1%~5%二甲基亞砜的液體培養(yǎng)基中，然后將盛有液體培養(yǎng)基的培養(yǎng) 瓶置于振蕩培養(yǎng)箱內，25 ± 2°C、黑暗條件下誘導處理24~52 h ; (3) 芽的誘導無菌條件下取出步驟（2)誘導處理過的楸葉泡桐葉片，用無菌水沖 洗:Γ5次，而后將其放置到步驟（1)中的MS固體培養(yǎng)基上，在溫度為25±2°C、光照強度 1300Lx、光照時間16 h/d的培養(yǎng)室內進行芽的誘導，30d時統(tǒng)計其誘導率
(4) 根的誘導經步驟（3)誘導出的芽長到1~3 cm時，無菌條件下將幼芽從靠近培養(yǎng) 基基部剪下，放入NAA濃度為(TO. 3 mg/L的1/2 MS生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)ΚΓ30 d，觀察其生 根率
(5) 楸葉泡桐變異植株鑒定取秋水仙素誘導變異植株長約2~3cm的芽在生根培養(yǎng)基 中繼代3~5次，待最后一次繼代幼芽根長至I. 0-3. 0 cm時，首先通過比較與未處理葉片誘 導幼苗的形態(tài)差異，初步篩選出變異植株，再用染色體計數(shù)法或流式細胞儀測定單細胞DNA 含量法對變異植株進行倍性鑒定； (6) 四倍體楸葉泡桐幼苗的移栽挑選出生長健壯、長勢齊整，根系生長良好，根系在3 cm以上的組培苗，然后煉苗移栽。
[0007] 所述固體培養(yǎng)基中蔗糖濃度為20g/L，瓊脂粉濃度為3. 0 g/L。
[0008] 步驟（2)中振蕩培養(yǎng)箱轉速為50~120 rpm。
[0009] 組培苗在移栽前，先在常溫下閉瓶煉苗3 d，再去掉瓶塞煉苗7 d，然后取出組培 苗，用清水洗去沾在根系上的培養(yǎng)基，之后在1%多菌靈溶液中浸泡I min，選擇少風的陰雨 天移栽，將幼苗移栽到用1% KMnO4消毒處理過的泥炭土和珍珠巖以3:1混合的基質中，21d 后，將幼苗栽植到營養(yǎng)盆中。
[0010] 采用上述技術方案的本發(fā)明具有以下優(yōu)點：本發(fā)明針對泡桐屬中楸葉泡桐目前國 內外還沒有誘導出四倍體楸葉泡桐的問題，以楸葉泡桐為材料，通過用秋水仙素和二甲基 亞砜培養(yǎng)液浸泡、振蕩培養(yǎng)其外植體，成功獲得了楸葉泡桐的四倍體植株。與現(xiàn)有的毛泡 桐、白花泡桐、蘭考泡桐、豫雜一號泡桐和南方泡桐四倍體誘導相比，該方法操作方便、四倍 體泡桐誘導率高。與以泡桐花蕾胎座為誘導材料誘導出的愈傷組織進行秋水仙素處理獲得 四倍體植株相比，本發(fā)明中的方法取材容易、廣泛，不受季節(jié)限制，并且四倍體泡桐誘導率 高；與以蘭考泡桐、白花泡桐、南方泡桐、豫雜一號泡桐和毛泡桐葉片為誘導材料，采用秋水 仙素固液雙層培養(yǎng)獲得四倍體植株的方法相比，該方法克服了固液雙層培養(yǎng)繁瑣的問題， 節(jié)省了誘導四倍體楸葉泡桐的時間和成本、提高了誘導效率?？傊?，本發(fā)明采用的四倍體泡 桐誘導方法，具有取材廣泛，操作簡單、方便，成本低，誘導率高等優(yōu)點，對不易獲得四倍體 的木本植物具有一定的指導意義。
【具體實施方式】 [0011] 實施例1 本發(fā)明公開的一種秋水仙素誘導楸葉泡桐同源四倍體的培育方法是通過如下步驟實 現(xiàn)的：（1)葉片預處理；（2)秋水仙素誘導處理；（3)芽誘導；（4)根誘導；（5)楸葉泡桐變 異植株鑒定；（6)四倍體楸葉泡桐幼苗的移栽。
[0012] 所述楸葉泡桐同源四倍體的培育方法具體步驟如下： (1) 葉片預處理取楸葉泡桐靠近莖尖處的2~4對葉，將葉片剪成1. 0 X 1.0 cm2的 方形小塊，無菌條件下將其置于MS+0. 3 mg/LNAA+14 mg/L BA的固體培養(yǎng)基中，在溫度為 20 ± 2°C的人工氣候箱內黑暗條件下處理4~8d ;所述MS固體培養(yǎng)基中蔗糖濃度為20g/L，瓊 脂粉濃度為3. 0 g/L ; (2) 秋水仙素誘導處理無菌條件下將經過步驟（1)預處理后的楸葉泡桐葉片置于含 15~45 mg/L秋水仙素和1%~5%二甲基亞砜的液體培養(yǎng)基中，然后將盛有液體培養(yǎng)基的培養(yǎng) 瓶置于5(T120 rpm振蕩培養(yǎng)箱內，25±2°C、黑暗條件下誘導處理24~52 h; (3) 芽的誘導無菌條件下取出步驟（2)誘導處理過的楸葉泡桐葉片，用無菌水沖 洗:Γ5次，而后將其放置到步驟（1)中的MS固體培養(yǎng)基上，在溫度為25±2°C、光照強度 1300Lx、光照時間16 h/d的培養(yǎng)室內進行芽的誘導，30d時統(tǒng)計其誘導率
(4) 根的誘導經步驟（3)誘導出的芽長到1~3 cm時，無菌條件下將幼芽從靠近培養(yǎng) 基基部剪下，放入NAA濃度為(TO. 3 mg/L的1/2 MS生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)ΚΓ30 d，觀察其生 根率
(5) 楸葉泡桐變異植株鑒定取秋水仙素誘導變異植株長約2~3cm的芽在生根培養(yǎng)基 中繼代3~5次，待最后一次繼代幼芽根長至I. 0-3. 0 cm時，首先通過比較與未處理葉片誘 導幼苗的形態(tài)差異，初步篩選出變異植株，再用染色體計數(shù)法或流式細胞儀測定單細胞DNA 含量法對變異植株進行倍性鑒定，楸葉泡桐四倍體誘變率4. 2%~1