一種用于國(guó)槐離體葉片體胚誘導(dǎo)快繁的成套培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于國(guó)槐離體葉片體胚誘導(dǎo)快繁的成套培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 國(guó)槐（Sophora japonica Linn)，別名家槐、中國(guó)槐，屬蝶形花亞科、槐屬。國(guó)槐為 落葉喬木，樹勢(shì)優(yōu)美，花期較長(zhǎng)，極耐修剪，耐寒、耐旱、耐空氣污染，又是吉祥、幸福、美好的 象征，是理想的行道樹種和庭院綠化樹種，而且國(guó)槐材質(zhì)優(yōu)良，花、果實(shí)、根皮、樹皮可入藥， 種子可榨油制皂，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，應(yīng)用前景十分廣闊。目前，國(guó)槐是嫁接龍爪槐、金枝 槐、聊紅槐、蝴蝶槐等觀賞品種的唯一砧木樹種，苗木需求大。國(guó)槐主要以種子繁殖為主，但 其開花結(jié)果具有大小年現(xiàn)象，且種子易受病蟲害危害，干癟、空洞現(xiàn)象嚴(yán)重。常規(guī)的育種方 法，依靠種子或扦插繁殖，難以滿足生產(chǎn)的需求，基于此有必要對(duì)國(guó)槐進(jìn)行組培快繁研究， 提供優(yōu)質(zhì)、大量國(guó)槐種苗，切實(shí)解決國(guó)槐苗木需求的瓶頸。
[0003] 國(guó)槐古樹資源歷經(jīng)千百年的風(fēng)霜?dú)q月，具有最原始的長(zhǎng)壽和抗逆基因，但由于各 種原因，衰老死亡的現(xiàn)象時(shí)常發(fā)生。就古槐衰敗的現(xiàn)狀來看，常表現(xiàn)為樹干腐朽空洞、冠形 殘缺、頂梢枯萎、枝葉凋零、病蟲害嚴(yán)重、根系生長(zhǎng)不良等等。這些古槐是大自然和前人留給 我們的寶貴的基因資源。
[0004]近年來，利用生物轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育具有抗性如抗逆、抗蟲、抗病等新型品種是國(guó)槐 育種的新趨勢(shì)。到目前為止，對(duì)槐樹的形成層培養(yǎng)、莖培養(yǎng)、葉片培養(yǎng)、胚培養(yǎng)、未授粉子房 的培養(yǎng)均已獲得了完整的植株，對(duì)原生質(zhì)的培養(yǎng)也取得了一定的進(jìn)展。袁秀云等利用國(guó)槐 的子葉和下胚軸產(chǎn)生了不定芽，王喆之等利用花藥培養(yǎng)形成了單倍體植株，Han K.H等 (1993，1997)將直徑為0.5~1.0cm的枝條消毒后，取出形成層接入愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo) 愈傷，再將愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，獲得了叢生芽，將成苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，可誘導(dǎo) 生根。上述的方法存在的缺點(diǎn)：由于國(guó)槐為多年生木本植物，其再生率普遍較低，出芽少，直 接影響了國(guó)槐的遺傳轉(zhuǎn)化。利用植物體胚誘導(dǎo)技術(shù)不但能達(dá)到保存母株優(yōu)良基因、快速繁 育的目的，還是提高基因遺傳轉(zhuǎn)化或誘變育種的重要途徑。目前，有關(guān)國(guó)槐的體細(xì)胞胚誘導(dǎo) 技術(shù)研究的較少，可以參考的現(xiàn)有技術(shù)比較少。國(guó)槐為多年生喬木，基因組龐大，鑒于基因 型的限制，其他物種的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的繁殖技術(shù)對(duì)國(guó)槐沒有參考價(jià)值。在這一方面，即使是 同一物種，不同的品種之間，體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基也不相同。例如，同樣是國(guó)槐，同一種培養(yǎng)基， 對(duì)黃金槐適合，對(duì)金葉槐就不適合。
[0005] 專利CN 102499086 A公開了一種刺槐的繁殖方法，以不同胚齡的合子胚為外植 體，以MS+2，4-D+BA+蔗糖+瓊脂為胚性愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基；以MS基本培養(yǎng)基+MES+谷氨 酰胺+水解酪蛋白+萘乙酸+6-芐氨基腺嘌呤+蔗糖+瓊脂為體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基，通過對(duì)愈 傷組織的誘導(dǎo)，形成球形胚后將其轉(zhuǎn)接到MS+水解酪蛋白培養(yǎng)基上，進(jìn)行體細(xì)胞胚的成熟培 養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接到MS基本培養(yǎng)基上萌發(fā)形成完整小植株。該專利使用刺槐的不同胚齡的合子 胚(莢果)作為原料進(jìn)行體細(xì)胞培養(yǎng)，不論是刺槐還是國(guó)槐，其每年的花期以及果實(shí)期都是 固定的兩個(gè)月左右，所以在進(jìn)行體細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)具有時(shí)間的局限性；國(guó)槐的離體葉片、不成熟 的合子胚均可誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體。但是，在山東地區(qū)，最近幾年的國(guó)槐小峰危害非常嚴(yán)重，很 難采到無蟲害的完整種子。其次，相對(duì)于國(guó)槐葉片誘導(dǎo)來說，不成熟合子胚的誘導(dǎo)時(shí)間更 長(zhǎng)，且誘導(dǎo)出的叢生芽也不如葉片誘導(dǎo)的多。因此，本專利采用取材方便、誘導(dǎo)率高的葉片 進(jìn)行國(guó)槐體胚誘導(dǎo)。國(guó)槐與刺槐分屬不同的屬，物種差別較大，不能參考莢果的體細(xì)胞培養(yǎng) 得到葉片的體細(xì)胞培養(yǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的就是為了解決上述問題，提供一種用于國(guó)槐離體葉片體胚誘導(dǎo)快繁 的成套培養(yǎng)。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] -種用于國(guó)槐離體葉片體胚誘導(dǎo)快繁的成套培養(yǎng)基，包括芽啟動(dòng)培養(yǎng)基、試管苗 增殖培養(yǎng)基、體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基、不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基、壯苗培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，其中：
[0009] 所述芽啟動(dòng)培養(yǎng)基是指:MS+5. Og/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5.8~6.0;
[0010] 所述試管苗增殖培養(yǎng)基是指:MS+1 · 0~2 · Omg/LBA+1 · 0~2 · Omg/LIBA+5 · Og/L瓊脂 +30g/L 蔗糖，pH值5.8 ~6.0;
[0011] 所述體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基是指:MS+3.0~5.0mg/L 2,4-D+0.5~1.0mg/L BA+0.5 ~1.0mg/L NAA+0.1~0.5mg/L TDZ+0.5~1.0mg/L谷氨酰胺+0.5~1.0mg/L CH(水解酪蛋 白）+5 · 0g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5 · 8~6 · 0;
[0012] 所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是指：MS+0 · 1~0 · 5mg/L ΒΑ+0 · 1~0 · 5mg/L ΝΑΑ+0 · 5~ 1 · 0mg/L谷氨酰胺+0 · 5~1 · 0mg/L CH(水解酪蛋白）+5 · 0g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5 · 8~ 6.0；
[0013] 所述壯苗培養(yǎng)基MS+5 · 0g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5 · 8~6 · 0;
[0014] 所述生根培養(yǎng)基是指：1/2MS+0.1 ~0.5mg/L ΙΒΑ+0~0.05mg/L NAA+5.0g/L瓊脂+ 20g/L蔗糖，pH值5.8~6.0;所述1/2MS指的是MS全量減半。
[0015] 所述MS包括常量營(yíng)養(yǎng)元素、微量營(yíng)養(yǎng)元素和有機(jī)試劑。
[0016] 所述的常量營(yíng)養(yǎng)元素的組分和其對(duì)應(yīng)的濃度如下：硝酸鉀1900mg/L，硝酸銨 1650mg/L，七水硫酸鎂370mg/L，無水磷酸二氫鉀170mg/L，二水氯化|丐44〇11^凡，乙二胺四乙 酸二鈉37 · 3mg/L，七水硫酸亞鐵27 · 8mg/L。
[0017]所述的微量營(yíng)養(yǎng)元素的組分和其對(duì)應(yīng)的濃度如下：四水硫酸錳22.3mg/L，硫酸鋅 8 · 6mg/L，硼酸6 · 2mg/L，碘化鉀0 · 83mg/L，鉬酸鈉0 · 25mg/L，硫酸銅0 · 025mg/L，氯化鈷 0.025mg/L〇
[0018] 所述的有機(jī)試劑的組分和其對(duì)應(yīng)的濃度如下：鹽酸硫胺素10mg/L，煙酸1.0mg/L， 鹽酸吡咳醇I .Omg/L，肌醇100mg/L。
[0019] 有益效果：
[0020] 體細(xì)胞胚發(fā)生的因素包括內(nèi)因和外因，內(nèi)因包括物種和基因型，外因主要涉及培 養(yǎng)基中附加成分的種類和濃度。即使是同一屬的植物，由于基因型不同，體細(xì)胞胚發(fā)生頻率 相差極大，原因如下：一是不同基因型體細(xì)胞胚發(fā)生頻率不同，二是不同基因型的最適誘導(dǎo) 條件不同。外植體的生理狀態(tài)和發(fā)育程度都直接影響體細(xì)胞胚的發(fā)生，一般生理代謝旺盛 而分化程度較低的組織有利于體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)。
[0021]對(duì)于培養(yǎng)基中必需的生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸，還原性氮鹽和外源氨 基酸，PH值等其他因素，他們的作用方向、作用程度都不相同。誘導(dǎo)植物體細(xì)胞胚發(fā)生的因 素眾多，但它們的作用程度不盡相同，各種因子通過轉(zhuǎn)錄與翻譯水平復(fù)雜而精確地調(diào)控，使 體細(xì)胞胚發(fā)生的相關(guān)基因在時(shí)間上和空間上得以選擇性激活和表達(dá)，只有各種因素配合使 用時(shí)才能快速、高效地誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚。
[0022] 外植體的生理狀態(tài)和發(fā)育程度都直接影響體細(xì)胞胚的發(fā)生，一般生理代謝旺盛而 分化程度較低的組織有利于體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)，葉片相較于花芽、花藥、子葉、子房中的合子 胚，各種單細(xì)胞，游離的小孢子、原生質(zhì)體以及體細(xì)胞胚本身的分化程度都高，做體細(xì)胞誘 導(dǎo)的難度也更大。
[0023] 發(fā)明人綜合考慮影響國(guó)槐葉片體細(xì)胞胚發(fā)生的各種因素，圍繞提高再生率、增加 出芽，提高植株移栽成活率等目的，設(shè)計(jì)了本發(fā)明的一套培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基相較于其他的培 養(yǎng)基再生率高、出芽多，植株移栽成活率可達(dá)到95 %以上，種苗生長(zhǎng)健壯，不但可有效解決 優(yōu)良種苗種質(zhì)退化問題，還可為國(guó)槐遺傳轉(zhuǎn)化或誘變育種提供一個(gè)理想的受體系統(tǒng)
[0024] 使用本發(fā)明的培養(yǎng)基繁殖國(guó)槐幼苗，可省去先建立國(guó)槐快繁再生體系這一步驟， 大大節(jié)省時(shí)間。
【附圖說明】
[0025] 圖1離體葉片劃傷口；
[0026] 圖2經(jīng)過暗培養(yǎng)形成胚性愈傷組織；
[0027]圖3光照培養(yǎng)形成黏性愈傷組織；
[0028]圖4愈傷組織誘導(dǎo)出叢生芽；
[0029] 圖5切割叢生芽進(jìn)行快繁培養(yǎng)；
[0030] 圖6長(zhǎng)成小苗；
[0031] 圖7小苗生根；
[0032]圖8移栽到花盆中煉苗；
[0033]圖9成活后花盆中單株種植。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面結(jié)合附圖與實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0035] 實(shí)施例一：
[0036] 選取生長(zhǎng)健壯、性狀表現(xiàn)優(yōu)良的單株，取其無病蟲害的當(dāng)年生嫩枝，除去多余的莖 葉，用洗潔精仔細(xì)清洗后，流水沖洗1小時(shí)，清洗干凈后，切割成適當(dāng)大小準(zhǔn)備消毒。
[0037]將試材置于超凈工作臺(tái)上，用70%的酒精消毒30s，無菌水沖洗3次，再用0.1%升 汞滅菌lOmin，無菌水沖洗5次，用滅菌濾紙吸干水分，然后剪取Icm左右?guī)б粋€(gè)腋芽或頂芽 的莖段，垂直插入芽啟動(dòng)培養(yǎng)基(MS+5. Og/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5.8)中。每瓶接種3個(gè)莖 段，誘導(dǎo)頂芽和腋芽萌發(fā)。經(jīng)過15d的培養(yǎng)，莖段腋芽或頂芽開始萌動(dòng)，莖尖明顯伸長(zhǎng)，40d左 右芽點(diǎn)可長(zhǎng)成2cm左右的新梢。
[0038]將誘導(dǎo)出的新梢，切下接種在試管苗增殖培養(yǎng)基(MS+2.0mg/L BA+2.0mg/L IBA+ 5. Og/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5.8)中。一般莖基部有少量愈傷產(chǎn)生并從愈傷處長(zhǎng)出2~3個(gè) 小芽，25d繼代1次，通過連續(xù)幾次繼代培養(yǎng)，可獲得試驗(yàn)所需無菌試管苗。
[0039]以試管苗第3到第6片展開葉片為材料，葉片帶短葉柄，葉片背面朝上放置在培養(yǎng) 皿中，用手術(shù)刀片垂直于葉片主脈輕輕劃3刀，不要?jiǎng)澲寥~邊緣。葉背朝下緊貼培養(yǎng)基放置， 接種在體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS+3.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L BA+0.5mg/L NAA+0.1mg/L TDZ+ 0 · 5mg/L谷氨酰胺+0 · 5mg/L CH(水解酪蛋白）+5 ·Og/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5 · 8)中。暗培養(yǎng) 30d，誘導(dǎo)體胚的形成。開始，葉片慢慢變硬變厚，逐漸形成愈傷組織，經(jīng)過30d的暗培養(yǎng)，外 植體變?yōu)闇\黃色黏狀愈傷組織。
[0040] 將上述愈傷組織轉(zhuǎn)接到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+0 · 3mg/L ΒΑ+0 · lmg/L ΝΑΑ+0 · 5mg/ L谷氨酰胺+0.5mg/L CH(水解酪蛋白）+5. Og/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5.8)中。放入溫度白 天25 ± 2°C，夜晚20 ± 2°C，光照強(qiáng)度1000~15001X，光照時(shí)間16h/d的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，愈傷組 織逐漸增殖。在此環(huán)境中培養(yǎng)90d，中間用同種培養(yǎng)基繼代兩次。繼代一次后，愈傷組織出現(xiàn) 綠色的芽點(diǎn)。再繼續(xù)繼代一次，綠色的芽點(diǎn)逐漸長(zhǎng)成1~2cm的小苗。
[0041 ]將小苗從基部切下，轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基(MS+5. Og/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5.8)中，進(jìn) 行壯苗培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境同上。大約培養(yǎng)25d，小苗長(zhǎng)至3~4cm高。
[0042]將小苗從基部剪下，去除小苗下半部分的葉片，插入生根培養(yǎng)