一種單純皰疹病毒感染樹鼩動物模型的構(gòu)建、評估方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種HSV感染樹駒動物模型的構(gòu)建、評估方法及其應(yīng)用，屬于人類疾病動物模型技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景
[0002]單純皰疹病毒(Herpes Simplex Virus，HSV):是人類最常見的病原體，世界人口中超過80 %的人都感染過HSV，一旦感染則終身潛伏?？梢鹂诖桨捳?、角膜炎、皰疹病毒性腦炎和生殖器皰疹。HSV能引起人類多種疾病，如銀口炎(gingivostomatitis)、角膜結(jié)膜炎(keratoconjunctivitis)、腦炎(encephalitis)以及生殖系統(tǒng)感染和新生兒的感染。在感染宿主后，常在神經(jīng)細(xì)胞中建立潛伏感染，激活后又會出現(xiàn)無癥狀的排毒，在人群中維持傳播鏈，周而復(fù)始的循環(huán)。
[0003]目前，嚙齒類是研究皰疹病毒潛伏感染的主要實(shí)驗(yàn)動物，嚙齒類的小鼠和家兔模型中已有HSV經(jīng)眼睛接種感染的報(bào)道，但由于嚙齒類與靈長類差距甚遠(yuǎn)，并不能完整地模擬人類皰疹病毒感染的情況。通常HSV-1經(jīng)眼睛接種途徑感染小鼠后，病毒會在小鼠的三叉神經(jīng)節(jié)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生裂解感染，在神經(jīng)元內(nèi)大量復(fù)制，導(dǎo)致被感染的神經(jīng)元死亡，引起動物大量死亡;然而，我們知道人類感染皰疹或病毒再激活時，并沒有在皰疹組織部位失去知覺，表明在人類感覺神經(jīng)中樞(包括三叉神經(jīng)節(jié))不存在神經(jīng)元死亡，這是嚙齒類模型無法解釋的現(xiàn)象。此外，小鼠模型缺乏對病毒的臨床再激活能力，家兔模型與人類感染的免疫反應(yīng)差異較大，且家兔實(shí)驗(yàn)成本高。因此，建立一個與人類或靈長類更接近的動物模型，來研究單純皰疹病毒潛伏感染機(jī)制顯得尤為重要。
[0004]樹駆](Tupaia belangeri)在分類學(xué)上屬哺乳綱，有胎盤類，是一個獨(dú)立的目，稱為攀駒目(Scandentia)，介于靈長目與食蟲目之間。樹駒具有體型小，易飼養(yǎng)和操作，管理方便，廉價經(jīng)濟(jì)，且其進(jìn)化程度高，新陳代謝和大體解剖比犬、大小鼠等動物與人更為接近，解剖結(jié)構(gòu)也更近似于人，因此其作為較理想的實(shí)驗(yàn)動物，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)與生物學(xué)的研究中。
[0005]雖然19世紀(jì)七八十年代，Darai ,Schwaier等已經(jīng)有關(guān)于HSV腹腔感染樹駆]的報(bào)道，但目前尚未見關(guān)于樹駒HSV潛伏感染模型的深入研究報(bào)道。建立最接近于人類的靈長類動物HSV感染模型，可以評估目前這些治療方法的有效性和安全性，是將其最終應(yīng)用于臨床治療的必經(jīng)途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]鑒于現(xiàn)在對HSV病毒感染實(shí)驗(yàn)動物模型開發(fā)的需求，本發(fā)明擬設(shè)計(jì)一種HSV病毒感染模型的建立及評估方法，通過單純皰疹病毒經(jīng)眼睛接種感染樹駒，建立HSV感染樹駒模型，為研究皰疹類病毒的感染機(jī)制，致病機(jī)理及藥物治療研究提供更好的實(shí)驗(yàn)動物模型。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種單純皰疹感染樹駒動物模型的構(gòu)建方法是將HSV-1病毒經(jīng)樹駒眼睛接種感染HSV病毒，建立單純皰疹感染樹駒動物模型，包括以下步驟:
[0008](I)實(shí)驗(yàn)動物準(zhǔn)備:準(zhǔn)備6月-3歲齡雌性成年健康樹駒；
[0009](2)樹駒的麻醉及處理:用氯胺酮麻醉動物，將樹駒固定于專用的小布袋中，稱量并記錄其體重，在樹駒大腿內(nèi)側(cè)肌肉豐厚處注射鹽酸氯胺酮，5分鐘后，樹駒處于麻醉狀態(tài)；
[0010](3)病毒感染:將HSV-1病毒滴加到樹駒兩只眼膜上，即可得到單純皰疹感染樹駒動物模型。
[0011]其中，步驟(3)中所述的HSV病毒為野生型HSV-1 17+或HSV-1 McKrae毒株。
[00?2] 進(jìn)一步地，步驟(2)中所述的氯胺酮(ketamine)的用量為按樹駆]體重為50mg/kg?100mg/kgo
[0013]進(jìn)一步地，步驟(3)中當(dāng)采用HSV-117+病毒時，需要以Iml注射器針頭劃痕動物眼膜，即建立表面劃痕，橫豎各劃痕十次，然后將HSV-1 17+病毒滴加到樹駒眼膜。
[0014]進(jìn)一步地，步驟⑶中采用的病毒感染劑量為I X 14PFU/眼睛?I X 16PFU/眼睛。
[0015]本發(fā)明提供了一種評估單純皰疹感染樹駒動物模型的方法，取材病毒感染樹駒的三叉神經(jīng)節(jié)(TG)和腦組織，利用PCR( Po Iymerase Chain React 1n )、qRT-PCR(quantitative real-time polymerase chain react1n)、免疫組化、免疫焚光、原位雜交、體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、組織活病毒檢測及病毒基因組定量等方法，對樹駒腦和三叉神經(jīng)節(jié)組織的感染、病毒潛伏及重激活進(jìn)行研究，鑒定及評估HSV潛伏感染樹駒模型。
[0016]利用以上發(fā)明方法構(gòu)建的單純皰疹感染樹駒動物模型在單純皰疹病毒、單純皰疹病毒性腦炎、單純皰疹病毒性角膜炎等發(fā)病機(jī)制機(jī)理研究和治療方面的應(yīng)用。
[0017]經(jīng)研究和分析，在HSV-1感染的樹駒三叉神經(jīng)節(jié)中可檢測到潛伏感染的HSV-1病毒，且潛伏的病毒可重激活;但三叉神經(jīng)節(jié)中表現(xiàn)出一種溫和的急性感染癥狀，檢測不到有感染活性的病毒。這些結(jié)果表明樹駒的HSV-1急性感染并不引起感覺神經(jīng)元死亡，這一現(xiàn)象與人類皰疹病毒的感染情況相類似。人類皰疹病毒復(fù)發(fā)，大多引起皮膚皰疹，且皰疹患處并不失去痛覺。HSV-1感染的樹駒腦組織中可檢測到感染的HSV-1病毒，且病毒可潛伏和原位重激活，這些都與小鼠感染HSV模型有很大的區(qū)別，這一結(jié)果對病毒性腦炎的研究具有重要意義。
[0018]本發(fā)明的有益效果:I)選用更接近于人類或靈長類的樹駒，首次成功建立單純皰疹病毒感染樹駒模型，能更好地模擬人類HSV-1感染，可為HSV-1感染機(jī)制及抗病毒藥物治療研究提供更好的實(shí)驗(yàn)動物模型;2)用本發(fā)明的方法構(gòu)建出單純皰疹病毒感染樹駒模型的病變特點(diǎn)與人類感染臨床表現(xiàn)近似，模型重復(fù)性、穩(wěn)定性好，適用于各種治療性研究和相關(guān)的基礎(chǔ)性研究，為進(jìn)一步研究HSV-1相關(guān)特性、發(fā)病機(jī)理、及相關(guān)病毒感染疾病如腦炎等藥物篩選、疫苗評價等方面的研究奠定了基礎(chǔ);3)該構(gòu)建方法操作簡單，技術(shù)、設(shè)備要求低，成功率高。
【附圖說明】
[0019]圖1為小鼠和樹駒感染HSV-1后的存活率圖；
[0020]圖2為小鼠和樹駒TG中HSV-1活病毒滴度的檢測比較圖；
[0021 ]圖3為小鼠和樹駒TG中HSV-1病毒基因組載量的檢測量圖；
[0022]圖4為原位雜交檢測HSV-1感染的樹駒TG的LAT信號圖，其中圖4A為對照組的樹駒TG中檢測不到LAT信號顯示圖，圖4B為感染后第7天的樹駒TG中檢測到的LAT信號顯示圖，圖4C為感染后第28天的樹駒TG中檢測到的LAT信號顯示圖，和4D為感染后第58天的樹駒TG中檢測到的LAT信號顯示圖；
[0023]圖5為樹駒TG與RS-1細(xì)胞體外共培養(yǎng)圖；
[0024]圖6為小鼠和樹駒腦中HSV-1活病毒滴度的檢測比較圖；
[0025]圖7為免疫組化檢測小鼠和樹駒腦中的HSV-1抗原檢測比較圖，其中圖7A為小鼠對照組中免疫組化檢測不到HSV-1抗原信號圖，圖7B為小鼠感染HSV-1 5天后免疫組化檢測到的HSV-1抗原信號圖；圖7C為樹駒對照組中免疫組化檢測不到HSV-1抗原信號圖，圖7D為樹駒感染HSV-1 8天后免疫組化檢測到的HSV-1抗原信號圖；
[0026]圖8為潛伏感染的小鼠和樹駒腦中HSV-1重激活率比較圖，其中圖8A為不同時間點(diǎn)潛伏感染的小鼠和樹駒嗅球中HSV-1重激活率比較圖，圖8B為不同時間點(diǎn)潛伏感染的小鼠和樹駒腦干中HSV-1重激活率比較圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]為能進(jìn)一步了解本發(fā)明的
【發(fā)明內(nèi)容】
及特點(diǎn)，通過以下實(shí)施例，并配合附圖詳細(xì)說明，請參閱附圖1-8。下述實(shí)施例中的方法如無特別說明，均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法。
[0028]以下實(shí)施例中，
[0029]A實(shí)驗(yàn)動物為6月_3歲齡雌性成年樹鼠句(Tupaia belangeri chinensis)，購于中國科學(xué)院昆明動物研究所靈長類研究中心。6周齡雌性BALB/c小鼠，購于昆明醫(yī)