一種鞍帶石斑魚精子大容量、高效超低溫冷凍保存的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬海洋生物技術領域，具體地說是一種鞍帶石斑魚精子穩(wěn)定、高效超低溫冷凍保存的方法。
【背景技術】
[0002]鞍帶石斑魚(Epinephelus Ianceolatus)又稱龍是或龍膽石斑，隸屬于f盧形目，魚旨科，石斑魚亞科，石斑魚屬，是石斑魚類群中體型最大的魚類，有巨石斑之稱，英文稱為giant grouper。鞍帶石斑魚主要產(chǎn)地在東南亞、澳洲海域，在中國的南海海域亦有分布。鞍帶石斑魚適宜在海水池塘和海水網(wǎng)箱中養(yǎng)殖，生長快，肉質(zhì)好，食用價值高，具有很好的養(yǎng)殖前景。近幾年，中國的廣東、福建、海南等南方沿海地區(qū)相繼開展鞍帶石斑魚人工養(yǎng)殖，并取得良好的養(yǎng)殖效益。但目前中國鞍帶石斑魚的人工繁殖和育苗仍處于試驗階段，雖有部分企業(yè)在人工繁育技術上有所突破，但生產(chǎn)技術尚未成熟，苗種培育生產(chǎn)效果不穩(wěn)定，從而制約了鞍帶石斑魚養(yǎng)殖的發(fā)展。因此很多企業(yè)采用按帶石斑魚的精液與其他種類石斑魚進行雜交的方法獲得生長快的雜交種。其中珍珠龍膽即為鞍帶與棕點雜交的該兩種。由于石斑魚是雌性先熟，雄性后熟并具有性逆轉(Sex reversal)特性，雄性親魚獲得較難，優(yōu)質(zhì)精子難以獲得，是石斑魚苗種規(guī)?；a(chǎn)受到限制的一個重要因素。尤其對于鞍帶石斑魚等待雄魚性成熟時個體達到幾十甚至上百公斤，因此集中批量保存優(yōu)質(zhì)鞍帶石斑魚精液，在需要時解凍進行人工授精獲得受精卵，從而克服了鞍帶石斑魚優(yōu)質(zhì)精液供不應求的困難。建立鞍帶石斑魚精子超低溫保存的可靠方法對促進鞍帶石斑魚苗種規(guī)?；嘤约胺N質(zhì)資源的保護都具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種鞍帶石斑魚精子穩(wěn)定、高效超低溫冷凍保存的方法。
[0004]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案為:
[0005]—種鞍帶石斑魚精子大容量、高效超低溫冷凍保存的方法，將鞍帶石斑魚的精液與抗凍液按體積比2:1-4:1的比例混合，混合后經(jīng)過一步平衡，三步降溫處理后投入到液氮(_196°C)，分裝保存;抗凍液由稀釋液、抗凍劑、添加劑三部分組成；
[0006]其中，稀釋液為NaCl7.5-7.8g/L,MgS04.7H20 0.1-0.12g/L,CaCl20.1-0.12g/L,Na2HPO4.2H20 0.1-0.12g/L，NaHCO30.4-0.5g/L; 15-20 % PG (丙二醇)；添加劑:海藻糖 15-20g/L，蛋黃5-10%。(百分比皆體積百分比以稀釋液為基準加入)
[0007]所述鞍帶石斑魚的精液與抗凍液在碎冰中(0°C)輕輕震蕩、充分混勻5_8min，而后以-12°C-15°C/min的降溫速率使溫度降至-140°C-150°C，然后投入到液氮(_196°C)，分裝保存。
[0008]所述抗凍液在使用前放置于0°C冰箱中預冷過夜，待用。
[0009]將混合均勻的鞍帶石斑魚精液分裝于5ml-10ml的凍存管中；
[0010]將經(jīng)液氮處理分裝保存的鞍帶石斑魚凍精進行解凍，將其直接放入35_37°C水浴110s-130s，然后置于室溫18-20°C放置至完全融化，而后于自然海水中激活。
[0011]激活后復蘇，具體是載玻片滴入10yL海水，然后加入l-2yL凍精，用移液器吸打3-5次混勻，隨即去3個視野，檢測運動的精子數(shù)量占視野中所有精子數(shù)量的比例，經(jīng)檢測凍精相對復蘇率高于95 %。
[0012]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0013]1.本發(fā)明冷凍保存過程中采用丙二醇作抗凍劑，保持較好滲透性的同時丙二醇的毒性較小，保護效果作用穩(wěn)定；
[0014]2.本發(fā)明抗凍液中加入了海藻糖15_20g/L和5-10%蛋黃作為細胞外部保護劑，對精子的質(zhì)膜起到很好的保護作用；
[0015]3.本發(fā)明冷凍保存過程中采用并且2:1-4:1的精液與抗凍液的比例，5ml-10ml凍存管進行保存，將實際的保存效率提高了近100倍。
[0016]4.降溫前鮮精與抗凍液震蕩混勻8-10min，直接放入程序降溫儀中，節(jié)省了時間，操作簡便易行；
[0017]5.同時精子與抗凍液的比例為2:1 — 4:1比以往1: 3 — 1:1的保存，利于人工授精，同時節(jié)約精液；
[0018]6.本發(fā)明冷凍保存過程采用一步降溫，采用以-12°C- —15°C/min速度降溫，直接降至-140°C—150°C，投入液氮，加快保存速度，提高保存效率。整個保存過程不超過1min;冷凍保存降溫程序精密，重復性穩(wěn)定性好，好凍精解凍后復蘇率高，激活后相對復活率高于90%，與鮮精活力狀態(tài)差異不顯著；
[0019]7.本發(fā)明冷凍精子從液氮中取出后，采用35°C_37°C解凍，可使精子快速度過重結晶區(qū)，同時又避免了局部溫度過高導致的損傷。
【具體實施方式】
[0020]本發(fā)明的鞍帶石斑魚精子高效冷凍保存方法獲得的高質(zhì)量的凍精對于石斑魚種間人工雜交、種質(zhì)保存、遺傳多樣性及可持續(xù)養(yǎng)殖等方面有著重要意義。
[0021 ]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明:
[0022]實施例1:
[0023]I )2013年8月份正值鞍帶石斑魚生殖生殖期，于膠南通用水產(chǎn)有限公司親魚車間，親魚養(yǎng)殖車間，將雄魚從養(yǎng)殖池中撈出，放置于海綿上，蒸餾水沖洗生殖孔三次，紙巾擦凈，輕輕從后向前擠壓腹部獲得I尾雄魚的新鮮精液20ml，存于干凈的離心管中，避光，顯微鏡檢測活力高于95%，置于冰盒中回實驗室進行冷凍保存，置于冰盒中進行冷凍保存；
[0024]2)抗凍液配制，由稀釋液、丙二醇、海藻糖和蛋黃組成，配置后置于0°C冰箱預冷，待用；其中，稀釋液為:NaCl 7.5g/L，MgS04.7H200.lg/L, CaCl20.lg/L ,Na2HPO4.2H200.lg/L，NaHCO30.35g/L；12%PG(丙二醇)；添加劑:蔗糖 15_20g/L，和5-10%蛋黃。
[0025]抗凍液的配置過程:首先用蒸餾水配置稀釋液，秤取NaCl 7.5g,MgSO4.7H200.Ig，CaCl20.Ig,Na2HPO4.2H20 0.Ig,NaHCO30.35g，海藻糖 15_20g，蛋黃 100ml，然后定容至IL備用;采用已配置的稀釋液作為基礎液配置抗凍液，其中含12%PG(V:V)(即10mL抗凍液含12mlPG)。
[0026]3)將上述鮮精與抗凍液以體積2:1 (鮮精:抗凍液)的比例混合，而后在碎冰中(O°C)輕輕震蕩、充分混勾5min，分裝至5ml凍存管中。
[0027]4)將凍存管置于降溫儀中以_12°C/min降溫速率降溫至_150°C，將所有的凍存管倒入盛有液氮的泡沫盒中，然后逐一順序放入凍存盒然后放入液氮容器中長期貯存(-196°C)；
[0028]5)將上述冷凍保存3個月后精液進行解凍，任意選取3個凍存管解凍，解凍前將凍存盒先置于盛有液氮的保溫盒中，然后將凍存管快速從盒中取出放入35-37°C水浴鍋中，輕輕搖動120s，然后置于室溫18-20°C至完全融解；
[0029]6)將上述融解后精液用自然海水激活，激活后取l_2yL激活后凍精滴加至
[0030]滴入10yL海水的載玻片，然后用移液器吸打3-5次混勻，在顯微鏡下檢測隨即去3個視野，檢測運動的精子數(shù)量占視野中所有精子數(shù)量的比例，經(jīng)檢測凍精相對復蘇率高于95%。
[0031]實施例2
[0032]1)2013年9月份正值鞍帶石斑魚生殖期，于膠南通用水產(chǎn)有限公司親魚車間，將雄魚從養(yǎng)殖池中撈出，放置于海綿上，蒸餾水沖洗生殖孔三次，紙巾擦凈，輕輕從后向前擠壓腹部獲得鮮精。共采集鞍帶石斑魚2尾，共計鮮精50ml，顯微鏡檢測活力95%，置于冰盒中回實驗室進行冷凍保存，置于冰盒中進行冷凍保存。
[0033]2)抗凍液配制，由稀釋液、抗凍劑、添加劑和蒸餾水組成，配置后置于0°C冰箱預冷，待用；其中，稀釋液為:NaCl 7.5g/L，MgS04.7H20 0.lg/L,CaCl20.lg/L,Na2HPO4.2H200.lg/L，NaHCO30.4g/L，抗凍劑:15 %PG(丙二醇)；添加劑:海藻糖25g/L，蛋黃 10 %。
[0034]抗凍液的配置過程:首先用蒸餾水配置稀釋液，秤取NaCl 7.5g,MgSO4.7H20
0.lg,CaCl20.lg,Na2HPO4.2H20 0.lg，NaHC030.4g，海藻糖25g，100ml，然后定容至 1L，精液冷凍保存前向上述定容后混合液體中加入15 % PG (丙二醇)(即取85mL容后混合液體加入15mLPG)0
[0035]3)將上述鮮精與抗凍液以體積4:1 (鮮精:抗凍液)的比例混合，而后在碎冰中(O°C)輕輕震蕩、充分混勻lOmin，分裝至1ml凍存管中，同時程序降溫儀開啟，預冷至0°C;
[0036]4)將凍存管置于降溫儀中以-15°C/min降溫速率降溫至-150°C，將所有的凍存管倒入盛有液氮的泡沫盒中，然后逐一順序放入凍存盒然后放入液氮容器中長期貯存(-196°C)；
[0037]5)將上述冷凍保存I年后精液進行解凍，任意選取3個凍存管解凍，解凍前將凍存盒先置于盛有液氮的保溫盒中，然后將凍存管快速從盒中取出放入35_37°C水浴鍋中，輕輕搖動130s，然后置于室溫18-20°C放置于振蕩器震蕩30s至完全融解；
[0038]6)將上述融解后精液用自然海水激活，激活后取l_2yL激活后凍精滴加至
[0039]滴入10yL海水的載玻片，然后用移液器吸打3-5次混勻，在顯微鏡下檢測隨即去3個視野，檢測運動的精子數(shù)量占視野中所有精子數(shù)量的比例，經(jīng)檢測凍精相對復蘇率高于95%，同時凍精均作快速的直線運動。
【主權項】
1.一種鞍帶石斑魚精子大容量、高效超低溫冷凍保存的方法，其特征在于:將鞍帶石斑魚的精液與抗凍液按體積比2:1-4:1的比例混合，混合后經(jīng)過一步平衡，三步降溫處理后投入到液氮(_196°C)，分裝保存;所述抗凍液由稀釋液、抗凍劑、添加劑三部分組成； 其中，稀釋液為 NaCl 7.5-7.8g/L，MgS04.7H20 0.1-0.12g/L，CaCl2 0.1-0.12g/L,Na2HPO4.2H20 0.1-0.12g/L，NaHCO3 0.4_0.5g/L; 15_20%PG(丙二醇)；添加齊丨」:海藻糖 15-20g/L，蛋黃5-10 %。(百分比皆以稀釋液為基準加入)。2.按權利要求1所述的鞍帶石斑魚精子高效超低溫冷凍保存的方法，其特征在于:所述鞍帶石斑魚的精液與抗凍液在碎冰中(0°C)輕輕震蕩、充分混勻5-8min，而后以-12°C—15°C/min的降溫速率使溫度降至-140°C-150°C，然后投入到液氮(_196°C)，分裝保存。3.按權利要求1或2所述的鞍帶石斑魚精子高效超低溫冷凍保存的方法，其特征在于:所述抗凍液在使用前放置于0°C冰箱中預冷過夜，待用。4.按權利要求1所述的鞍帶石斑魚精子高效超低溫冷凍保存的方法，其特征在于:將混合均勾的鞍帶石斑魚精液分裝于5ml-10ml的凍存管中。5.按權利要求1所述的鞍帶石斑魚精子高效超低溫冷凍保存的方法，其特征在于:將經(jīng)液氮處理分裝保存的鞍帶石斑魚凍精進行解凍，將其直接放入35-37°C水浴110s-130s，然后置于室溫18-20°C放置至完全融化，而后于自然海水中激活。
【專利摘要】本發(fā)明屬海洋生物技術領域，具體地說是一種鞍帶石斑魚精子大容量、高效超低溫冷凍保存的方法。將鞍帶石斑魚的精液與抗凍液按體積比2：1-4:1的比例混合，混合后經(jīng)過一步平衡，三步降溫處理后投入到液氮(-196℃)，分裝保存；所述抗凍液由稀釋液、抗凍劑、添加劑三部分組成；本發(fā)明的鞍帶石斑魚精子高效冷凍保存方法獲得的高質(zhì)量的凍精對于石斑魚種間人工雜交、種質(zhì)保存、遺傳多樣性及可持續(xù)養(yǎng)殖等方面有著重要意義。
【IPC分類】A01N1/02
【公開號】CN105532639
【申請?zhí)枴緾N201510957452
【發(fā)明人】劉清華, 肖志忠, 李軍, 王學穎
【申請人】中國科學院海洋研究所
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2015年12月18日