一種促進(jìn)牛樟芝液態(tài)發(fā)酵生長和三萜合成的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種促進(jìn)牛樟芝液態(tài)發(fā)酵生長和三萜合成的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]牛樟芝又名牛樟燕，學(xué)名Antrodiacamphorata，被譽(yù)為“森林紅寶石”，是中國臺灣特有的真菌，僅生長于中國臺灣特有的牛樟樹(Cinnamomum kanehirai)上。牛樟芝作為傳統(tǒng)藥材，被中國臺灣民間長期用于解酒保肝，治療肝痛、肝癌、腹痛、腹瀉、炎癥等，有著顯著療效。現(xiàn)代研究表明，牛樟芝子實體中含有包括三萜類、多糖類、固醇類、腺苷類、不飽和脂肪酸、免疫蛋白等在內(nèi)的多種功能性成分，具有抑制腫瘤、抗膽堿、抗乙肝表面抗原、抗炎癥、抗氧化等功效，有著廣泛的保健和藥用價值。由于牛樟木資源稀缺，牛樟芝市場需求量增大，導(dǎo)致樟樹盜閥，濫采，野生牛樟芝市場價格居高不下。目前中國臺灣方面已經(jīng)采取措施進(jìn)行保護(hù)，并將其專一寄生的牛樟木列為保護(hù)樹種，禁止出口。由于牛樟芝護(hù)肝保肝效果驚人，目前牛樟芝市場價每公斤達(dá)十幾萬甚至幾十萬，市場前景巨大。
[0003]鑒于牛樟木資源的稀缺和牛樟芝的顯著功效，微生物領(lǐng)域人士將目光聚焦于牛樟芝的人工培養(yǎng)和液態(tài)深層發(fā)酵上。牛樟芝人工固體培養(yǎng)周期較長，較難得到子實體，且仍然需要牛樟木。液體深層發(fā)酵方面已有較多的研究，但總體上菌絲收獲量不大，以三萜類化合物為代表的活性成分含量相對較低。
[0004]龍腦樟屬樟科植物，是天然冰片的主要提取來源。近年來在我國湖南新晃、江西吉安等地已有相當(dāng)?shù)呐嘤N植規(guī)模及產(chǎn)業(yè)鏈。龍腦樟樹中龍腦的前體物質(zhì)是異戊二烯多聚體，與牛樟樹完全相同，是牛樟芝菌代謝產(chǎn)生麥角留醇骨架烯萜類有效成分的重要物質(zhì)。這啟示我們可以利用龍腦樟提取物質(zhì)促進(jìn)牛樟芝菌絲體的生長和三萜類化合物的合成。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是液態(tài)發(fā)酵時牛樟芝菌絲及其所含活性成分三萜類化合物合收率較低，發(fā)酵效率不高的問題。
[0006]本發(fā)明的目的正是為了克服上述技術(shù)的不足，而提供一種促進(jìn)牛樟芝液態(tài)發(fā)酵生長和三萜合成的方法，具體涉及一種添加龍腦樟提取物質(zhì)促進(jìn)牛樟芝液態(tài)發(fā)酵中菌絲生長及三萜類化合物合成的方法，使牛樟芝菌絲體量提高了 14 %，菌絲中三萜含量提高了 60 %。
[0007]本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案來完成的。這種促進(jìn)牛樟芝液態(tài)發(fā)酵生長和三萜合成的方法，在發(fā)酵起始和菌體生長到特定階段，分兩次加入龍腦樟提取物，以促進(jìn)牛樟芝菌絲的生長和三萜類化合物的合成。龍腦樟提取物先制成乙酸乙酯溶液，經(jīng)0.22μπι有機(jī)微濾膜過濾除菌后備用;發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌完成降至常溫后，進(jìn)行移種，隨即加入龍腦樟提取物溶液，添加量為0.5?10mg/L，然后進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)溶氧降至20%以下時，再次加入龍腦樟提取物溶液，添加量為5?50mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)直至發(fā)酵結(jié)束。
[0008]所加入的龍腦樟提取物為龍腦樟樹枝或樹葉粉碎后，采用有機(jī)溶劑提取、或蒸汽蒸餾、或CO2超臨界萃取得到提取物。
[0009]所添加的龍腦樟提取物為有機(jī)溶劑提取法或CO2超臨界萃取法所得時，初次添加量最好為5?10mg/L，二次添加量最好為30?50mg/L;所添加的龍腦樟提取物為蒸汽蒸饋法所得時，初次添加量最好為0.5?5mg/L，二次添加量最好為5?15mg/L。
[0010]本發(fā)明有益效果是:本發(fā)明公開的一種添加龍腦樟提取物促進(jìn)牛樟芝液態(tài)發(fā)酵菌絲生長和三萜類化合物合的方法，可使牛樟芝的生物量提高14%，菌絲中三萜類化合物的含量提高60%，提高了牛樟芝液態(tài)發(fā)酵的效率，降低生產(chǎn)成本。
【具體實施方式】
[0011]下面通過【具體實施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，實施例將幫助更好地理解本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅僅局限于下述實施例。
[0012]這種促進(jìn)牛樟芝液態(tài)發(fā)酵生長和三萜合成的方法，向發(fā)酵體系中加入龍腦樟提取物，可以提高牛樟芝菌絲量及三萜含量。龍腦樟提取物先制成乙酸乙酯溶液，經(jīng)0.22μπι有機(jī)微濾膜過濾除菌后備用;發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌完成降至常溫后，進(jìn)行移種，隨即加入龍腦樟提取物溶液，添加量為0.5?10mg/L，然后進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)溶氧降至20%以下時，再次加入龍腦樟提取物溶液，添加量為5?50mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)直至發(fā)酵結(jié)束。與對照不添加組相較，本方法可使牛樟芝液態(tài)發(fā)酵生物量提高14%，菌絲中三萜含量提高60%。
[0013]所加入的龍腦樟提取物為龍腦樟樹枝或樹葉粉碎后，采用有機(jī)溶劑提取、或蒸汽蒸餾、或CO2超臨界萃取得到提取物。所添加的龍腦樟提取物為有機(jī)溶劑提取法或CO2超臨界萃取法所得時，初次添加量最好為5?10mg/L，二次添加量最好為30?50mg/L;所添加的龍腦樟提取物為蒸汽蒸饋法所得時，初次添加量最好為0.5?5mg/L，二次添加量最好為5?15mg/L。
[0014]實施例1:
[0015]1.培養(yǎng)基:
[0016]斜面培養(yǎng)基:綜合PDA培養(yǎng)基；
[0017]種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，蛋白胨5，酵母粉5，大豆粉5，磷酸氫二鉀I，硫酸鎂
0.6ο
[0018]發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖35，蛋白胨5，酵母粉5，大豆粉5，磷酸氫二鉀I，硫酸鎂
0.6ο
[0019]2.提取物制備:將龍腦樟樹枝粉碎后，用5倍的乙酸乙酯常溫下提取2次，合并提取液，將提取液減壓濃縮、蒸干，備用。使用時，取提取物用乙酸乙酯制成20mg/ml的溶液，用0.22μηι有機(jī)膜過濾后備用。
[0020]3.培養(yǎng)方法
[0021]I)種子液培養(yǎng):牛樟芝菌種經(jīng)斜面活化后，接種于種子瓶20-30°C培養(yǎng)3-5天得到種子液。成熟種子液接種于種子罐，設(shè)定培養(yǎng)溫度20_30°C、轉(zhuǎn)速100_150r/min、通氣量0.3-
0.5vvm，培養(yǎng)周期2-5天。
[0022]2)發(fā)酵培養(yǎng):將上述種子液移入發(fā)酵罐，移種量5%_15%，按5mg/L的比例加入提取物溶液(以所含提取物計)，培養(yǎng)溫度20-30 °C、轉(zhuǎn)速50-100r/min、通氣量0.3-0.5vvm;當(dāng)溶氧下降至20%時，按30mg/L的比例加入提取物溶液(以所含提取物計)，培養(yǎng)周期4-6天。
[0023]4.處理及結(jié)果:發(fā)酵結(jié)束后收集菌絲體，烘干，稱重并檢測三萜類化合物含量。測得牛樟芝菌絲體收獲量提高了 15 %，菌絲中三萜含量提高了 63 %。
[0024]實施例2:
[0025]與上述實施例不同的是:龍腦樟提取物制備采用CO2超臨界萃取法;發(fā)酵中首次加入提取物量為7mg/L;溶氧下降至20%時，加入提取物量40mg/L。結(jié)果取得了同樣的增產(chǎn)效果O
[0026]實施例3:
[0027]與上述實施例不同的是:龍腦樟提取物制備采用蒸汽蒸餾法;發(fā)酵中首次加入提取物量為0.8mg/L;溶氧下降至20%時，加入提取物量10mg/L。結(jié)果取得了同樣的增產(chǎn)效果。
[0028]最后，應(yīng)當(dāng)指出，以上實例僅是本發(fā)明較有代表性的例子。顯然，本發(fā)明的技術(shù)方案并不限于上述實例，還可以有許多變形，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1.一種促進(jìn)牛樟芝液態(tài)發(fā)酵生長和三萜合成的方法，其特征是:龍腦樟提取物先制成乙酸乙酯溶液，經(jīng)0.22μπι有機(jī)微濾膜過濾除菌后備用;發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌完成降至常溫后，進(jìn)行移種，隨即加入龍腦樟提取物溶液，添加量為0.5?lOmg/l，然后進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)溶氧降至20 %以下時，再次加入龍腦樟提取物溶液，添加量為5?50mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)直至發(fā)酵結(jié)束。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進(jìn)牛樟芝液態(tài)發(fā)酵生長和三萜合成的方法，其特征是:所加入的龍腦樟提取物為龍腦樟樹枝或樹葉粉碎后，采用有機(jī)溶劑提取、或蒸汽蒸餾、或0)2超臨界萃取得到提取物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的促進(jìn)牛樟芝液態(tài)發(fā)酵生長和三萜合成的方法，其特征是:所添加的龍腦樟提取物為有機(jī)溶劑提取法或CO2超臨界萃取法所得時，初次添加量最好為5?10mg/L，二次添加量最好為30?50mg/L;所添加的龍腦樟提取物為蒸汽蒸餾法所得時，初次添加量最好為0.5?5mg/L，二次添加量最好為5?15mg/L。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種促進(jìn)牛樟芝液態(tài)發(fā)酵生長和三萜合成的方法，龍腦樟提取物先制成乙酸乙酯溶液，經(jīng)0.22μm有機(jī)微濾膜過濾除菌后備用；發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌完成降至常溫后，進(jìn)行移種，隨即加入龍腦樟提取物溶液，添加量為0.5～10mg/L，然后進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)溶氧降至20％以下時，再次加入龍腦樟提取物溶液，添加量為5～50mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)直至發(fā)酵結(jié)束。本發(fā)明方法可有效促進(jìn)牛樟芝菌絲的生長和三萜類化合物的合成，發(fā)酵結(jié)束后牛樟芝生物量提高14％，菌絲中三萜含量提高60％，可應(yīng)用于牛樟芝及其活性成分的規(guī)模化生產(chǎn)。
【IPC分類】A01G1/04
【公開號】CN105580638
【申請?zhí)枴緾N201510952926
【發(fā)明人】劉國, 李海龍, 邊軍英
【申請人】浙江亞林生物科技股份有限公司
【公開日】2016年5月18日
【申請日】2015年12月17日