一種玉米成熟胚組織培養(yǎng)中的種子消毒方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種玉米成熟胚組織培養(yǎng)中的種子消毒方法。
【背景技術(shù)】
[0002]玉米(Zea mays L.)為禾本科玉米屬一年生草本植物，也是重要的糧食、飼料和工業(yè)原料作物。根據(jù)《中國農(nóng)村經(jīng)濟形勢分析與預(yù)測(2013)》，2012年玉米總產(chǎn)量首次超過稻谷成為我國第一大糧食品種。玉米的組織培養(yǎng)研究是玉米生物技術(shù)育種的基礎(chǔ)性工作，一直深受重視。相對于玉米幼胚，玉米成熟種子易于大量保存，不受生長季節(jié)和數(shù)量限制，可以隨時取用，因此，成熟玉米種子是一種較理想的適用于玉米組織培養(yǎng)的外植體。玉米種子消毒是成熟胚組織培養(yǎng)的第一步，對玉米成熟胚組織培養(yǎng)的成功有重要影響。
[0003]現(xiàn)有的報道中，大部分玉米種子消毒實驗中使用0.1%升汞(HgCl2)作為消毒劑(如項艷等，2007;賈秀萍等，2008;程莉等，2009 ;孔維萍，2010 ;裴冬麗等，2011;樸連玉等，2013)，也有使用0.2%升汞的報道(何婷等，2009)，上述報道所用的消毒劑具有不易去除，對組培材料的傷害較大，對環(huán)境有污染等缺點，而在玉米成熟胚培養(yǎng)中采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%次氯酸鈉進行玉米種子消毒的方法卻鮮有報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種玉米成熟胚組織培養(yǎng)中的種子消毒方法。
[0005]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的:
一種玉米成熟胚組織培養(yǎng)中的種子消毒方法，包括如下步驟:
1)挑選大小均勻、無明顯異色、籽粒飽滿的玉米種子備用；
2)取步驟I)挑選的玉米種子用自來水沖洗，沖洗時間為20-30分鐘，然后將沖洗后的玉米種子置于超凈工作臺上用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%酒精漂洗，漂洗的時間為0.5-1分鐘，漂洗以后接著再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的次氯酸鈉消毒漂洗后的玉米種子，消毒的時間為10分鐘，最后用無菌水沖洗3-5遍，即可。
[0006]所述的步驟2)中自來水沖洗時間為10-30分鐘，優(yōu)選為20分鐘。
[0007]所述的步驟2)中用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的次氯酸鈉消毒時間為8-14分鐘，優(yōu)選為10分鐘。
[0008]技術(shù)效果:本發(fā)明所述方法與現(xiàn)有的玉米成熟胚組織培養(yǎng)中的種子消毒方法采用的氯化汞相比，具有易去除，不留殘毒，對組培材料的傷害較小，沒有環(huán)境污染等優(yōu)點。
【具體實施方式】
[0009]實施例1
I)采用平育2B玉米種子，挑選大小均勻、籽粒飽滿的玉米種子分成五等份，分別裝入50ml三角瓶中備用；
2)取步驟I)挑選的玉米種子用自來水沖洗，沖洗時間為30分鐘，然后將沖洗后的玉米種子置于超凈工作臺上用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%酒精漂洗，漂洗的時間為I分鐘，漂洗以后接著再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的次氯酸鈉將酒精漂洗后的玉米種子分別消毒，消毒的時間依次為4min、6 min、8 min、10 min、12min，最后用無菌水沖洗 3-5 遍，
然后分別在裝有消毒處理后玉米種子的50ml三角瓶中，加入無菌水，以剛能浸沒為準(zhǔn)。將無菌水浸泡的消毒后的玉米種子放入培養(yǎng)箱中進行暗培養(yǎng)，溫度設(shè)為26°C，每天觀察種子生長情況，以種子長菌和無菌水變渾濁為污染標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)觀察4天。
[0010]實驗結(jié)論，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%次氯酸鈉溶液處理平育2B玉米種子8分鐘以上，玉米種子沒有出現(xiàn)污染現(xiàn)象，消毒效果較好。
[0011]在超凈工作臺內(nèi)，將無菌水浸泡72h的消毒后的玉米種子剝?nèi)〕墒炫撸嘏咻S縱切兩半，切口向下接種于MS愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基添加:Glu(L-谷氨酸)(300 mg/L) + CH (水解酪蛋白)(500 mg/L) + Pro (L-脯氨酸)(700 mg/L) +KT(激動素)(0.5 mg/L)+3%蔗糖+瓊脂(7.5g/L)，2，4-D (2，4-二氯苯氧乙酸)濃度為lmg/L，pH 5.8.在此基礎(chǔ)上，在26°C智能光照培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，三周后統(tǒng)計玉米成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率為39.3%。
[0012]實施例2
1)采用鄭單958玉米種子，挑選大小均勻、籽粒飽滿的玉米種子分成五等份，分別裝入50ml三角瓶中備用；
2)取步驟I)挑選的玉米種子用自來水沖洗，沖洗時間為30分鐘，然后將沖洗后的玉米種子置于超凈工作臺上用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%酒精漂洗，漂洗的時間為I分鐘，漂洗以后接著再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的次氯酸鈉將酒精漂洗后的玉米種子分別消毒，消毒的時間依次為4min、6 min、8 min、10 min、12min，最后用無菌水沖洗 3-5 遍，
然后分別在裝有消毒處理后玉米種子的50ml三角瓶中，加入無菌水，以剛能浸沒為準(zhǔn)。將無菌水浸泡的消毒后的玉米種子放入培養(yǎng)箱中進行暗培養(yǎng)，溫度設(shè)為26°C，每天觀察種子生長情況，以種子長菌和無菌水變渾濁為污染標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)觀察4天。
[0013]實驗結(jié)論，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%次氯酸鈉溶液處理鄭單958玉米種子8分鐘以上，玉米種子沒有出現(xiàn)污染現(xiàn)象，消毒效果較好。
[0014]在超凈工作臺內(nèi)，將無菌水浸泡72h的消毒以后的玉米種子剝?nèi)〕墒炫?，沿胚軸縱切兩半，切口向下接種于MS愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基添加:Glu (300 mg/L) + CH (500 mg/L) + Pro (700 mg/L)+KT (0.5 mg/L) +3% 蔗糖 + 瓊脂(7.5g/L)，2，4-D濃度為2mg/L，pH 5.8.在此基礎(chǔ)上，在26°C智能光照培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，三周后統(tǒng)計玉米成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率為44.4%。
[0015]實施例3
O采用神56玉米種子，挑選大小均勻、籽粒飽滿的玉米種子分成五等份，分別裝入50ml三角瓶中備用；
2)取步驟I)挑選的玉米種子用自來水沖洗，沖洗時間為30分鐘，然后將沖洗后的玉米種子置于超凈工作臺上用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%酒精漂洗，漂洗的時間為I分鐘，漂洗以后接著再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的次氯酸鈉將酒精漂洗后的玉米種子分別消毒，消毒的時間依次為4min、6 min、8 min、10 min、12min，最后用無菌水沖洗 3-5 遍，
然后分別在裝有消毒處理后玉米種子的50ml三角瓶中，加入無菌水，以剛能浸沒為準(zhǔn)。將無菌水浸泡的消毒后的玉米種子放入培養(yǎng)箱中進行暗培養(yǎng)，溫度設(shè)為26°C，每天觀察種子生長情況，以種子長菌和無菌水變渾濁為污染標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)觀察4天。
[0016]實驗結(jié)論，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%次氯酸鈉溶液處理神56玉米種子10分鐘以上，玉米種子沒有出現(xiàn)污染現(xiàn)象，消毒效果較好。
[0017]在超凈工作臺內(nèi)，將無菌水浸泡72h的消毒后的玉米種子剝?nèi)〕墒炫?，沿胚軸縱切兩半，切口向下接種于MS愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基添加:Glu (300 mg/L) + CH (500 mg/L) + Pro (700 mg/L)+KT (0.5 mg/L) +3% 蔗糖 + 瓊脂(7.5g/L)，2，4-D濃度為2mg/L，pH 5.8.在此基礎(chǔ)上，在26°C智能光照培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，三周后統(tǒng)計玉米成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率為54.3%。
[0018]實施例4
O采用鄭58玉米種子，挑選大小均勻、籽粒飽滿的玉米種子分成五等份，分別裝入50ml三角瓶中備用；
2)取步驟I)挑選的玉米種子用自來水沖洗，沖洗時間為30分鐘，然后將沖洗后的玉米種子置于超凈工作臺上用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%酒精漂洗，漂洗的時間為I分鐘，漂洗以后接著再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的次氯酸鈉將酒精漂洗后的玉米種子分別消毒，消毒的時間依次為4min、6 min、8 min、10 min、12min，最后用無菌水沖洗 3-5 遍，
然后分別在裝有消毒處理后玉米種子的50ml三角瓶中，加入無菌水，以剛能浸沒為準(zhǔn)。將無菌水浸泡的消毒后的玉米種子放入培養(yǎng)箱中進行暗培養(yǎng)，溫度設(shè)為26°C，每天觀察種子生長情況，以種子長菌和無菌水變渾濁為污染標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)觀察4天。
[0019]實驗結(jié)論，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%次氯酸鈉溶液處理鄭58玉米種子10分鐘以上，玉米種子沒有出現(xiàn)污染現(xiàn)象，消毒效果較好。
[0020]在超凈工作臺內(nèi)，將無菌水浸泡72h的消毒后的玉米種子剝?nèi)〕墒炫?，沿胚軸縱切兩半，切口向下接種于MS愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基添加:Glu (300 mg/L) + CH (500 mg/L) + Pro (700 mg/L)+KT (0.5 mg/L) +3% 蔗糖 + 瓊脂(7.5g/L)，2，4-D濃度為lmg/L，pH 5.8.在此基礎(chǔ)上，在26°C智能光照培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，三周后統(tǒng)計玉米成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率為60%。
【主權(quán)項】
1.一種玉米成熟胚組織培養(yǎng)中的種子消毒方法，其特征在于: 包括如下步驟: 1)挑選大小均勻、無明顯異色、籽粒飽滿的玉米種子備用； 2)取步驟I)挑選的玉米種子用自來水沖洗，沖洗時間為20-30分鐘，然后將沖洗后的玉米種子置于超凈工作臺上用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%酒精漂洗，漂洗的時間為0.5-1分鐘，漂洗以后接著再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的次氯酸鈉消毒漂洗后的玉米種子，消毒的時間為10分鐘，最后用無菌水沖洗3-5遍，即可。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種玉米成熟胚組織培養(yǎng)中的種子消毒方法，其特征在于:步驟2)中自來水沖洗時間為10-30分鐘，優(yōu)選為20分鐘。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種玉米成熟胚組織培養(yǎng)中的種子消毒方法，其特征在于:步驟2)中用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的次氯酸鈉消毒時間為8-14分鐘，優(yōu)選為10分鐘。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種玉米成熟胚組織培養(yǎng)中的種子消毒方法。包括如下步驟：1)挑選玉米種子備用；2)取步驟1)挑選的玉米種子沖洗，沖洗時間為20-30分鐘，然后將沖洗后的玉米種子置于超凈工作臺上用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75％酒精漂洗，漂洗的時間為0.5-1分鐘，漂洗以后接著再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％的次氯酸鈉消毒漂洗后的玉米種子，消毒的時間為10分鐘，最后用無菌水沖洗3-5遍。本發(fā)明所述方法與現(xiàn)有的玉米成熟胚組織培養(yǎng)中的種子消毒方法采用的氯化汞相比，具有易去除，不留殘毒，對組培材料的傷害較小，沒有環(huán)境污染等優(yōu)點。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105580731
【申請?zhí)枴緾N201410560780
【發(fā)明人】王洪振
【申請人】吉林師范大學(xué)
【公開日】2016年5月18日
【申請日】2014年10月21日