一種鐵皮石斛原球莖組織培養(yǎng)快速繁殖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種鐵皮石斛原球莖組織培養(yǎng)快速繁殖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鐵皮石斛(Dendrobium candidum Wall .ex Lindl)是蘭科石斛屬多年生附生草本 植物，是我國名貴的傳統(tǒng)中藥材之一，也是一種重要的花卉植物，分布于我國南方浙江、廣 西、福建、貴州、云南、安徽等省的原始森林中，有益胃生津，滋陰清熱，止咳潤肺等功效。由 于生長環(huán)境特殊，長期采挖，自然資源日趨枯竭，已被國家列為重點保護的野生藥材。同時， 鐵皮石斛的種子極小，無胚乳，自然條件下需與真菌共生才能萌發(fā)，繁殖速度慢，長勢不一 且變異率高。
[0003] 20世紀70年開始，鐵皮石斛的研究工作在組織培養(yǎng)、種植、藥理藥效方面發(fā)展很 快，但在鐵皮石斛的組織培養(yǎng)中存在組培苗生產(chǎn)成本高，移栽成活率低等問題。鐵皮石斛原 球莖是鐵皮石斛離體培養(yǎng)產(chǎn)生的組織，具有植株的物質(zhì)代謝和形態(tài)發(fā)育的潛能。一方面，鐵 皮石斛原球莖可以分化成苗，培養(yǎng)成植株，或者作為人工種子繁殖體解決試管苗移栽的問 題，另一方面可以從原球莖中直接提取有效的藥用成分，代替野生或栽培的植株。然而，鐵 皮石斛原球莖通過固體培養(yǎng)進行增殖，50-60天繼代一次，周期長增殖倍率不高，長勢不均 勻。
[0004] 有鑒于此，本發(fā)明研發(fā)出一種鐵皮石斛原球莖組織培養(yǎng)快速繁殖的方法，本案由 此產(chǎn)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種鐵皮石斛原球莖組織培養(yǎng)快速繁殖的方法，以提高增 殖倍率，實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化快速繁殖，該方法培育的鐵皮石斛原球莖分化率高，干重鮮重含量提 高，移栽成活率相應(yīng)提高。
[0006] 為達成上述目的，本發(fā)明的解決方案為：
[0007] -種鐵皮石斛原球莖組織培養(yǎng)快速繁殖的方法，包括以下步驟：
[0008] -，對外植體進行清洗、消毒，然后接入誘導培養(yǎng)基中進行誘導培養(yǎng)，誘導培養(yǎng)基 配比為:MS培養(yǎng)基，6-BA 0 · lmg/L，NAA 0 · 3mg/L，100g/L土豆泥，PH5 · 6-5 · 8，培養(yǎng)條件是光 照強度1500-2000lux，光照時間1 Oh，溫度25 ± 2°C ;
[0009] 二，將步驟一中誘導的原球莖接入液體增殖培養(yǎng)基中進行懸浮震蕩培養(yǎng)，液體增 殖培養(yǎng)基為：1/2MS培養(yǎng)基，6-BA 2 · Omg/L，NAA 0 · 5mg/L，蔗糖30g/L，PH5 · 6-5 · 8，培養(yǎng)條件 為采用工業(yè)搖床進行懸浮震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速l〇〇r/min，光照強度2000-25001UX，光照時間8h， 溫度25 ±2 Γ;
[0010] 三，將步驟二中獲得的原球莖轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得分化苗，培養(yǎng)基配方： 1/2MS培養(yǎng)基，6-BA 1 · 5-2 · 0mg/L，NAA 0 · 3-0 · 5mg/L，香蕉泥 100g/L，蔗糖20g/L，PH5 · 6-5.8，培養(yǎng)條件是光照強度2000-25001ux，光照時間12h，溫度25 ± 2°C ;
[0011] 四，將步驟三中l(wèi)_2cm高的苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中生根，生根培養(yǎng)基配比：1/2MS培 養(yǎng)基，NAA 1. Omg/L，香蕉泥100g/L，蔗糖20g/L，PH5.6-5.8，培養(yǎng)條件是光照強度2000-25001ux，光照時間 12h，溫度25 ± 2°C。
[0012] 進一步，步驟一中，選擇長勢旺盛的鐵皮石斛幼嫩枝條為外植體，去除所有葉片， 切除頂芽，然后將外植體放入含洗衣粉的水中浸泡l〇min，清水沖洗干凈轉(zhuǎn)移至無菌操作臺 上，用質(zhì)量濃度為75 %的酒精浸泡30s，無菌水沖洗2遍，再用質(zhì)量濃度為0.1 %的生汞消毒 7-8min，無菌水沖洗5次，瀝干，將莖段切成2-3cm帶節(jié)的莖段，接種到誘導培養(yǎng)基中。
[0013]進一步，步驟二中，鐵皮石斛原球莖液體增殖培養(yǎng)所采用的瓶子為85mm耐高溫PP 組培瓶，裝液量為瓶身的1/5-1/6，接種量為其裝液量的10 %-15 % (質(zhì)量濃度），置于旋裝式 工業(yè)搖床上進行震蕩培養(yǎng)。
[0014] 進一步，1/2MS培養(yǎng)基主要由 1000mg/L NH4N03、1500mg/L KN03、170mg/L KH2P〇4、 300mg/L無水CaCl2和 185mg/L MgS〇4 · 7H20組成。
[0015] 采用上述方案后，本發(fā)明解決鐵皮石斛原球莖增殖過程中周期長，增殖倍率低，生 產(chǎn)成本高等問題，實現(xiàn)商業(yè)化規(guī)?；焖俜庇?，45天增殖倍率達20-23倍，原球莖的干重達 到27.02g/L，分化效果好，生根率100 %，滿足工業(yè)化生產(chǎn)，為鐵皮石斛的推廣種植解決種苗 需求問題。
【具體實施方式】
[0016] 以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做詳細描述。
[0017] -種鐵皮石斛原球莖組織培養(yǎng)快速繁殖的方法，包括以下步驟：
[0018] -，外植體的預處理和誘導
[0019] 選擇長勢旺盛的鐵皮石斛幼嫩枝條為外植體，去除所有葉片，切除頂芽，然后將外 植體放入含洗衣粉的水中浸泡l〇min，自來水沖洗干凈轉(zhuǎn)移至無菌操作臺上，用質(zhì)量濃度 為75 %的酒精浸泡30s，無菌水沖洗2遍，再用質(zhì)量濃度為0.1 %的生汞消毒7-8min，消毒過 程中輕輕晃動瓶子使之充分接觸，最后無菌水沖洗5次，每次2min，瀝干，將莖段切成2-3cm 帶節(jié)的莖段，接種到誘導培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件:光照強度1500-20001uX，光照時間10h，溫度 25±2°C，誘導培養(yǎng)基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，土豆泥100g/L，分別添加不同濃度的6-BA和 NAA，考察激素對原球莖誘導的影響，結(jié)果見表1。從表1中可以看出較適合原球莖誘導的是 實驗組合2，原球莖誘導培養(yǎng)基為MS、6-BA 0. lmg/L、NAA0.3mg/L。
[0020] 表1不同激素組合對原球莖誘導率的影響
[0021]
[0022] 二、鐵皮石斛原球莖液體增殖培養(yǎng)
[0023] 將誘導萌發(fā)的鐵皮石斛原球莖直接接入到液體培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，原球莖的 液體增殖每隔15天更換一次培養(yǎng)液，換液時保留部分原有培養(yǎng)基再加入新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng) 45天后進入篩選程序，挑選結(jié)構(gòu)緊密，顆粒飽滿，顏色鮮綠，直徑大的原球莖進入分化階段 培養(yǎng)成分化苗；同時，當液體增殖的生物量達到一定程度時，可以將該原球莖做成藥源植 物，提取有效成分。
[0024] 1、液體增殖培養(yǎng)采用旋轉(zhuǎn)式大型工業(yè)搖床進行原球莖液體懸浮震蕩培養(yǎng)，鐵皮石 斛原球莖液體增殖培養(yǎng)所采用的瓶子為85mm耐高溫PP組培瓶，培養(yǎng)液的量為50ml，接種量 為7_8g。
[0025] 2、基本培養(yǎng)基及激素的選擇對原球莖液體增殖的影響
[0026] 2.1不同培養(yǎng)基對原球莖液體增殖的影響
[0027] 不同基本培養(yǎng)基中鹽濃度差異較大，鹽濃度不同導致滲透壓差異很大，這對原球 莖的增殖具有重要影響且影響后期的分化，因此選取合適的基本培養(yǎng)基至關(guān)重要。選取相 同條件下生長狀況良好的原球莖接到液體培養(yǎng)基中，以15、1/21^、85、冊為基本培養(yǎng)基，蔗 糖30g/L，30天后觀察原球莖增殖情況，見表2。由表2可以看出1/2MS較適宜作為原球莖液體 增殖的基本培養(yǎng)基，B5、N6由于含有高的鉀鹽濃度不利于原球莖增殖導致原球莖脫水死亡。
[0028] 表2不同培養(yǎng)基對原球莖液體增殖的影響
[0029]
[0031 ] 2.2不同激素對原球莖液體增殖的影響
[0032] 激素種類及濃度對原球莖的增殖有重要的影響作用，前期實驗顯示對原球莖液體 增殖有明顯影響的激素為6-BA和NAA，故本方案主要考慮6-BA、NAA兩種激素組合對原球莖 液體增殖的影響。基本培養(yǎng)基為1/2MS，蔗糖30g/L，接種量7-8g/瓶，裝液量50ml/瓶，光照強 度2000-25001ux，時間12h，PH5.6-5.8，轉(zhuǎn)速100r/min，45天后1瓶原球莖可以轉(zhuǎn)接9-11瓶原 球莖，按9瓶計算鮮重干重及增殖倍率，結(jié)果見表3。由表3可以看出不同濃度的激素組合對 原球莖的液體增殖倍率影響