一種利用油桐下胚軸為外植體直接誘導(dǎo)植株再生的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種利用油桐下胚軸為外植體直接誘導(dǎo)植株再生的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]油桐(Verniciafordii Hemsley)為大戟科(Euphorbiaceae)油桐屬(Vernicia)落葉喬木，是我國特有的經(jīng)濟樹種，與油茶、烏桕和核桃并稱我國四大木本油料植物。油桐是優(yōu)良的生物能源樹種，其種子含油率高達(dá)50 %?70%，其中約94%為不飽和脂肪酸，是一種可替代石化柴油的優(yōu)質(zhì)干性油，具有廣泛的應(yīng)用前景。我國生產(chǎn)的桐油品質(zhì)優(yōu)良，在國際上享有很高的聲譽，出口產(chǎn)量和質(zhì)量均居世界第一，是國內(nèi)、國際市場緊缺物資，國內(nèi)外需求量大，一直供不應(yīng)求。隨著生物質(zhì)能源林業(yè)的快速發(fā)展，油桐的栽培前景十分廣闊，市場需求量大，但缺乏高效的種苗繁育技術(shù)，成為制約其產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的瓶頸。目前在生產(chǎn)上，油桐的繁育主要以種子實生苗和嫁接為主，育苗過程普遍存在繁殖效率低，繁殖過程繁瑣等問題，很難滿足油桐規(guī)模推廣的需求。利用組培快繁技術(shù)，可在短期內(nèi)獲得大量的、遺傳背景一致的油桐植株，以滿足油桐規(guī)模化造林的需求;另外，在此基礎(chǔ)上對油桐品種進(jìn)行遺傳改良研究也迫在眉睫。
[0003]組織培養(yǎng)是快速繁殖優(yōu)良植物品種的重要途徑。目前，關(guān)于油桐的組織培養(yǎng)方面的研究很少，主要以油桐離體葉片、下胚軸為外植體通過間接器官發(fā)生途徑獲得植株再生和以葉柄為外植體通過直接器官發(fā)生途徑獲得植株再生，研究過程均存在可重復(fù)性差的問題。目前有關(guān)以油桐無菌苗下胚軸為外植體通過直接器官發(fā)生途徑實現(xiàn)植株再生還未見報道。本試驗以油桐無菌苗下胚軸為外植體，通過不定芽的誘導(dǎo)、繼代增殖、伸長、生根、馴化和移栽等過程，以期建立了一個穩(wěn)定的油桐離體再生體系，本發(fā)明培養(yǎng)周期短、培養(yǎng)程序簡單且可重復(fù)性好，為油桐快速繁殖以及后期的品種改良研究提供重要的技術(shù)支撐。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用油桐下胚軸為外植體直接誘導(dǎo)植株再生的方法。該方法利用油桐無菌苗幼嫩的下胚軸作為外植體誘導(dǎo)不定芽，培養(yǎng)周期短，可重復(fù)性高，誘導(dǎo)不定芽健壯，生根率高，可避免無性系變異的發(fā)生。同時還可應(yīng)用與遺傳轉(zhuǎn)化，對油桐的轉(zhuǎn)基因研究具有重要意義。
[0005]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題的:一種利用油桐下胚軸為外植體直接誘導(dǎo)植株再生的方法，包括下述步驟:
[0006]步驟一、取當(dāng)年生油桐成熟種子經(jīng)初步消毒后，于超凈工作臺中進(jìn)行表面消毒；
[0007]步驟二、將步驟一消毒后的種子，取胚接種于萌發(fā)培養(yǎng)基中進(jìn)行萌發(fā)；
[0008]步驟三、將萌發(fā)25?30d的無菌苗下胚軸切成適宜大小的切段，接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，經(jīng)過25?30d的光照培養(yǎng)，下胚軸的兩端誘導(dǎo)出不定芽；
[0009]步驟四、將帶有不定芽叢的下胚軸轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行芽的增殖；
[0010]步驟五、培養(yǎng)15?20d后轉(zhuǎn)至不定芽伸長培養(yǎng)基上進(jìn)行芽的伸長培養(yǎng)；
[0011 ]步驟六、待芽長至2?4cm，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根；
[0012]步驟七、待幼苗長至2?4cm并帶有2?4片真葉時，進(jìn)行煉苗并移栽，獲得健壯的油桐植株再生。
[0013]作為上述方案的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟一中的表面消毒是指選取優(yōu)質(zhì)的種子，剝?nèi)シN殼于流水下沖洗15?30min，期間添加2?4ml洗滌液。沖洗后，在超凈臺用無菌水洗3次后在75%酒精中浸泡60?120s，再用0.1 ^HgCl2處理3?6min，期間不?；蝿悠孔印Ｈ缓笥脽o菌水沖洗4?5次，充分洗掉殘余的消毒液。消毒完后，將種子放入無菌水中浸泡2?6h。
[0014]作為上述方案的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟二中的油桐種子胚的獲取是指將消毒后的種子，用鑷子和手術(shù)刀去除胚乳，獲得完整的胚，并將胚進(jìn)行萌發(fā)獲得無菌苗。
[0015]作為上述方案的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟三中的下胚軸適宜大小的切段是指將步驟二中獲得的無菌苗下胚軸切成0.3?0.6cm大小;所述的步驟三中的切段接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的方式為水平接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。
[0016]作為上述方案的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟三中的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+0.5?5.0mg/L6-BA+0.05?0.2mg/L IBA+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH=5.8。
[0017]作為上述方案的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟四中的不定芽的增殖培養(yǎng)基為:MS+0.5?4.0mg/L 6-BA+0.02?0.lmg/L IBA+30g/L鹿糖+7g/L瓊脂，pH=5.8。
[0018]作為上述方案的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟五中的不定芽的伸長培養(yǎng)基為:MS+0.5?4.0mg/L 6-BA+0.02?0.1mg/L ΙΒΑ+0.5?2.0mg/L GA3+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH=5.8。
[0019]作為上述方案的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟六中伸長芽的生根培養(yǎng)基為:l/2MS+0.05?1.0mg/L IBA+30g/L鹿糖+7g/L瓊脂，ρΗ=5.8。
[0020]作為上述方案的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟七中的的馴化和移栽的具體過程是指:將生根后的幼苗在濕度為70?80%的人工氣候箱中煉苗3?5d，從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移栽到營養(yǎng)土:珍珠巖:蛭石為2:1:1的混合基質(zhì)中，并用保鮮膜覆蓋保濕一周后揭開放在溫室中培養(yǎng)。
[0021]作為上述方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述的培養(yǎng)條件為溫度25±2°C，光照2000?2 5001X，光照時間14?16h/d。
[0022]目前有關(guān)油桐的組織培養(yǎng)研究較少，本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點:
[0023](I)本發(fā)明通過直接器官再生途徑獲得植株再生，具有培養(yǎng)周期短、培養(yǎng)程序簡單且可重復(fù)性好，同時通過直接再生能夠避免無性系變異的發(fā)生，保持母本植株的優(yōu)良特性，對于油桐品種的規(guī)模化快繁具有重要的意義。
[0024](2)本發(fā)明采用的外植體是無菌苗的下胚軸，屬于胚性器官，再生能力較強。
[0025](3)本發(fā)明可應(yīng)用于油桐的遺傳轉(zhuǎn)化體系研究中。目前，以下胚軸為外植體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化已經(jīng)在大豆中獲得成功。相對于葉柄和葉片，下胚軸在應(yīng)對抗生素選擇壓力上具有更好的耐受能力。同時，該過程不經(jīng)過脫分化階段，可保持母本的優(yōu)良性狀，且縮短了試驗周期，具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0026](4)本發(fā)明通過下胚軸誘導(dǎo)的不定芽長勢較好，芽點多，芽的伸長效果好，生根率高，培養(yǎng)周期短且可重復(fù)性高。
【附圖說明】
[0027]圖1為誘導(dǎo)前的油桐下胚軸切段。
[0028]圖2為下胚軸不定芽誘導(dǎo)。
[0029]圖3為下胚軸不定芽的增殖。
[0030]圖4為下胚軸不定芽的伸長。
[0031]圖5下胚軸不定芽的生根。
[0032]圖6油桐無菌苗的移栽。
【具體實施方式】
[0033]下面對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施例。
[0034]實施例1
[0035]1.選取大小均一、籽粒飽滿的種子，剝?nèi)シN殼流水沖洗15min，期間添加2ml洗滌劑。在超凈臺用無菌水洗3次后在75 %酒精中浸泡60s，再用0.1 %HgCl2處理3min，期間不?；蝿悠孔?。然后用無菌水沖洗4?5次，充分洗掉殘余的消毒液。消毒完后，將種子放入無菌水中浸泡2h。剝?nèi)ヅ呷?，將剝離的油桐成熟胚接于種子萌發(fā)培養(yǎng)基；
[0036]2.光照培養(yǎng)20?25d獲得油桐種子實生苗，選取無菌苗下胚軸切成0.3cm的小段，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基，于溫度為25°C，光照強度為2000?25001x，光照時間為14?16h/d的條件下進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)(圖1);其中所述的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L6-BA+0.05mg/LIBA+30g/L鹿糖+7g/L瓊脂，pH=5.8 ；
[0037]3.光照培養(yǎng)25?30d后，下胚軸兩端誘導(dǎo)出不定芽(圖2)，然后將誘導(dǎo)出不定芽的下胚軸轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽的增殖培養(yǎng)，其中所述的不定芽的增殖培養(yǎng)基為:MS+0.5mg/L6-BA+0.02mg/LIBA+30g/L 蔗糖+7g/L 瓊脂，pH=5.8 ；
[0038]4.光照培養(yǎng)15?20d后，將步驟3中增殖的不定芽(圖3)轉(zhuǎn)接于不定芽伸長培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽的伸長，其中所述的不定芽伸長培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L6-BA+0.02mg/LIBA+
0.5mg/LGA3+30g/L 鹿糖+7 g/L ,pH=5.8；
[0039]5.待不定芽伸長至2?4cm(圖4)時轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根，其中所述的生根培養(yǎng)基為 1/2MS+0.05mg/LIBA+30g/L 蔗糖+7g/L 瓊脂；
[0040]6.待無菌苗長至2-4cm，伴有強壯根系和2-4個伸展的真葉時(圖5