一種白芨共生菌的培育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種白芨共生菌的培育方法。
【背景技術(shù)】
[0002]白發(fā)[Bletillastriata (Thunb.) Reichb.f.]，又名白及，為蘭科植物。白發(fā)假鱗莖可入藥，能止血補(bǔ)肺、生肌止痛、潤筋行氣。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》主痛腫、惡瘡、敗疽、傷陰死肌、胃中邪氣”。《本草綱目》也指出:“白芨、斂氣、瘆痰、止血、消痛之藥也。此藥質(zhì)極粘膩，性極收澀、籍苦氣寒，善入肺經(jīng)，因熱壅血瘀而成疾者，以此研口服、軀堅(jiān)斂臟、封填破損、痛腫可消，潰敗可托，死肌可去，膿血可潔，有撫早生新之妙用也”。過去白芨主要靠野生繁殖的，但近年來由于白芨的需求不斷增加，野生植物資源急劇下降，白芨已成為珍稀瀕危物種，現(xiàn)已列入《瀕危動(dòng)植物國際貿(mào)易公約》予以保護(hù)。
[0003]為了滿足市場對白芨的需求，近年來人們開始采用人工栽培方法種植白芨。但目前研究較多的是白芨種苗的繁殖，沒有發(fā)現(xiàn)白芨種苗移栽到大田后的施肥技術(shù)研究，一般采用常規(guī)農(nóng)作物的施肥方法。因蘭科植物和菌根真菌之間存在營養(yǎng)物質(zhì)交換，主要是菌根真菌供給蘭科植物所需的無機(jī)鹽和有機(jī)化合物，蘭科植物菌根真菌與其它菌根真菌不同的是它們無法從宿主的根部獲取有機(jī)養(yǎng)份，必須從周圍環(huán)境中獲得，將其分解成葡萄糖等小分子碳水化合物后，供蘭科植物根系吸收利用。白芨為蘭科植物，種植到大田后如果按常規(guī)農(nóng)作物的施肥方法施肥，因缺少白芨菌根真菌，難以吸收和滿足白芨生長的營養(yǎng)需求，造成白芨種苗成活率低、白芨產(chǎn)量低和質(zhì)量差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對上述不足之處，提供一種白芨共生菌的培育方法，培育出的白芨共生菌施到白芨種苗移栽大田后，增加大田的白芨共生菌數(shù)量，優(yōu)化白芨生長的環(huán)境，提高白芨種苗成活率，提高白芨產(chǎn)量和質(zhì)量。
[0005]本發(fā)明包括白芨共生菌的提取、提純、復(fù)壯、原種擴(kuò)繁、栽培種擴(kuò)繁等如下步驟:
1、白芨塊莖根消毒處理:取新鮮野生白芨塊莖根部用清水沖洗3?5次除去泥砂雜質(zhì)，用洗衣粉水浸泡15?25min后，用無菌水沖洗4?5次，然后用75%乙醇浸泡25?30s后，用無菌水沖洗3?5次，用0.1?0.2%HgCl2浸泡6?8min后無菌水沖洗5?6次，用無菌濾紙吸干水分；
2、白芨共生菌的提取:將步驟I消毒處理后的白芨塊莖根在超凈工作臺(tái)上用經(jīng)消毒的剪刀剪成長0.2?0.5cm小段，接入滅菌后的TOA培養(yǎng)基上，在24?26°C溫度下暗培養(yǎng)，接種后7?8天獲得長滿整個(gè)培養(yǎng)基表面3?4cm長的白芨共生菌；
3、白芨共生菌的提純:將試管截去底部，管內(nèi)中間裝入木肩和闊葉樹樹葉配制的培養(yǎng)基，兩端加棉塞滅菌后，從一端接入步驟2得到的菌絲體后，在24?26 °C溫度下暗培養(yǎng)，菌絲吃料后向木肩深處延伸至另一端，15?20天后從另一端獲取純化菌種；
4、白芨共生菌的復(fù)壯:將步驟3得到的提純菌種轉(zhuǎn)接到滅菌后的RM改良培養(yǎng)基上，在24?26°C溫度下暗培養(yǎng)，7?8天后得到菌絲健壯的優(yōu)良菌種；
5、白芨共生菌的原種擴(kuò)繁:將原種培養(yǎng)基裝入玻璃培養(yǎng)瓶容積的2/3后，蓋上棉塞滅菌后接入步驟4得到的復(fù)壯菌種，在24?26°C溫度下暗培養(yǎng)，25?30天后菌絲長到瓶底，得到白芨共生菌的原種，原種培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比為:雜木肩39%，闊葉樹樹葉39%，麩皮20%，蔗糖1%，碳酸鈣1%，料水質(zhì)量比為1: 1.3?1.5;
6、白芨共生菌的栽培種擴(kuò)繁:將栽培種培養(yǎng)基裝入高密度低壓聚乙烯塑料袋內(nèi)滅菌，冷卻后接入步驟5得到的白芨共生菌的原種，在2?23°C溫度下暗培養(yǎng)，28?36天后得到白芨共生菌的栽培種，栽培種培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比為:雜木肩30%，闊葉樹樹葉48%，麥麩皮10%，玉米粉10%，蔗糖1%，石膏粉1%，料水質(zhì)量比為1: 1.3?1.5。
[0006]使用時(shí)，先將步驟5得到的白芨共生菌的栽培種埋于土下15?20cm處后，再移栽白芨苗，按常規(guī)的措施進(jìn)行田間管理。在云南省麗江市古城區(qū)金山辦事處經(jīng)過連續(xù)三年的使用實(shí)驗(yàn)表明，使用本發(fā)明的白芨共生菌大田種植白芨，比不使用本發(fā)明的白芨共生菌大田種植白芨相比，移栽后的苗成活率提高20%以上，產(chǎn)量增產(chǎn)40%以上，質(zhì)量有明顯的提高。
【具體實(shí)施方式】
[0007]本發(fā)明包括白芨共生菌的提取、提純、復(fù)壯、原種擴(kuò)繁、栽培種擴(kuò)繁，其【具體實(shí)施方式】為:
1、白芨塊莖根消毒處理:取新鮮野生白芨塊莖根部用清水沖洗3?5次除去泥砂雜質(zhì)，用洗衣粉水浸泡15?25min后，用無菌水沖洗4?5次，然后用75%乙醇浸泡25?30s后，無菌水沖洗3?5次，用0.I?0.2%HgCl2浸泡6?8min后無菌水沖洗5?6次，用無菌濾紙吸干水分；
2、白芨共生菌的提取:將步驟I消毒處理后的白芨塊莖根在超凈工作臺(tái)上用經(jīng)消毒的剪刀剪成長0.2?0.5cm小段，接入滅菌后的PDA培養(yǎng)基上，在24?26 °C溫度下暗培養(yǎng)，2?3天后即見白色柔毛狀菌絲長出，5?6天后菌絲已長長至3?4cm長，接種后7?8天獲得長滿整個(gè)培養(yǎng)基表面3?4cm長的白芨共生菌；PDA培養(yǎng)基為:馬鈴薯(去皮)200克，葡萄糖20克，瓊脂18?20克，水1000毫升;經(jīng)溫度120?125°C、壓力1.1?1.2Kgf/cm2下滅菌25?30min，冷卻后接入白芨塊莖根段材料；
3、白芨共生菌的提純:將試管截去底部，管內(nèi)中間裝入木肩和闊葉樹樹葉配制的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比為:雜木肩60%，闊葉樹樹葉30%，麩皮8%，蔗糖1%，石膏粉1%，料水質(zhì)量比為1:1.3?1.6，兩端加棉塞后，在溫度128?130°C、壓力I.5?1.6Kgf/cm2下滅菌120?150min，冷卻后從一端接入步驟3得到的菌絲體后，在24?26°C溫度下暗培養(yǎng)，菌絲吃料后向木肩深處延伸至另一端，15?20天后另一端獲取純化菌種，采用木肩濾菌法進(jìn)行過濾、提純，從而達(dá)到尚純度的白發(fā)共生菌菌種的目的；
4、白芨共生菌的復(fù)壯:將步驟3得到的提純菌種轉(zhuǎn)接到滅菌后的RM改良培養(yǎng)基上，在24?26°C溫度下暗培養(yǎng)，經(jīng)觀察第2天即可看到白色菌絲生長，第3?4天觀察，菌落生長為園形，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，7?8天后菌絲就可長滿培養(yǎng)基表面，此時(shí)，即可培育到生長旺盛，菌絲健壯的優(yōu)良菌種，經(jīng)表面觀察，試管內(nèi)菌絲正背面呈白色至淡紅色，RM改良培養(yǎng)基配方為:蛋白胨2克，葡萄糖20克，磷酸二氫鉀0.46克，磷酸氫二鉀I克，硫酸鎂0.5克，瓊脂15?20克，馬鈴薯200克，蒸餾水1000毫升，經(jīng)溫度120?125°C、壓力1.1?1.2Kgf/cm2下滅菌25?30min，冷卻后接入提純菌種；
5、白芨共生菌的原種擴(kuò)繁:將原種培養(yǎng)基裝入玻璃培養(yǎng)瓶容積的2/3后，蓋上棉塞后在溫度128?130°C、壓力1.5?1.6Kgf/cm2下滅菌120?150min，冷卻后接入步驟4得到的復(fù)壯菌種，在24?26°C溫度下暗培養(yǎng)，25?30天后菌絲長到瓶底，得到白芨共生菌的原種，原種培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比為:雜木肩39%，闊葉樹樹葉39%，麩皮20%，蔗糖1%，碳酸鈣1%，料水質(zhì)量比為1:1.3?1.5;
6、白芨共生菌的栽培種擴(kuò)繁:將栽培種培養(yǎng)基裝入高密度低壓聚乙烯塑料袋內(nèi)，培養(yǎng)基裝到容積的2/3后蓋上無棉蓋體在溫度95?100 °C常壓下滅菌18?22小時(shí)，冷卻后接入步驟5得到的白芨共生菌的原種，在20?23°C溫度下暗培養(yǎng)，25?30天后，菌絲即可長滿菌袋；此時(shí)再后熟培養(yǎng)3?6天，即可用于白芨苗拌菌栽培，栽培種培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比為:雜木肩30%，闊葉樹樹葉48%，麥麩皮10%，玉米粉10%，蔗糖1%，石膏粉1%，料水質(zhì)量比為1: 1.3?1.5。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種白芨共生菌的培育方法，其特征是包括如下步驟: (1)白芨塊莖根消毒處理:取新鮮野生白芨塊莖根部用清水沖洗3?5次除去泥砂雜質(zhì)，用洗衣粉水浸泡15?25min后，用無菌水沖洗4?5次，然后用75%乙醇浸泡25?30s后，用無菌水沖洗3?5次，用0.1?0.2%HgCl2浸泡6?8min后無菌水沖洗5?6次，用無菌濾紙吸干水分； (2)白芨共生菌的提取:將步驟(I)消毒處理后的白芨塊莖根在超凈工作臺(tái)上用經(jīng)消毒的剪刀剪成長0.2?0.5cm小段，接入滅菌后的PDA培養(yǎng)基上，在24?26°C溫度下暗培養(yǎng)，接種后7?8天獲得長滿整個(gè)培養(yǎng)基表面3?4cm長的白芨共生菌； (3)白芨共生菌的提純:將試管截去底部，管內(nèi)中間裝入木肩和闊葉樹樹葉配制的培養(yǎng)基，兩端加棉塞滅菌后，從一端接入步驟(2)得到的菌絲體后，在24?26 °C溫度下暗培養(yǎng)，菌絲吃料后向木肩深處延伸至另一端，15?20天后從另一端獲取純化菌種； (4)白芨共生菌的復(fù)壯:將步驟(3)得到的提純菌種轉(zhuǎn)接到滅菌后的RM改良培養(yǎng)基上，在24?26°C溫度下暗培養(yǎng)，7?8天后得到菌絲健壯的優(yōu)良菌種； (5)白芨共生菌的原種擴(kuò)繁:將原種培養(yǎng)基裝入玻璃培養(yǎng)瓶容積的2/3后，蓋上棉塞滅菌后接入步驟(4)得到的復(fù)壯菌種，在24?26 °C溫度下暗培養(yǎng)，25?30天后菌絲長到瓶底，得到白芨共生菌的原種，原種培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比為:雜木肩39%，闊葉樹樹葉39%，麩皮20%，蔗糖1%，碳酸鈣1%，料水質(zhì)量比為1: 1.3?1.5; (6)白芨共生菌的栽培種擴(kuò)繁:將栽培種培養(yǎng)基裝入高密度低壓聚乙烯塑料袋內(nèi)滅菌，冷卻后接入步驟(5)得到的白芨共生菌的原種，在2?23°C溫度下暗培養(yǎng)，28?36天后得到白芨共生菌的栽培種，栽培種培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比為:雜木肩30%，闊葉樹樹葉48%，麥麩皮10%，玉米粉10%，蔗糖1%，石膏粉1%，料水質(zhì)量比為1: 1.3?1.5。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白芨共生菌的培育方法，其特征是白芨共生菌的提純培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比為:雜木肩60%，闊葉樹樹葉30%，麩皮8%，蔗糖1%，石膏粉1%，料水質(zhì)量比為1:1.3 ?1.6。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白芨共生菌的培育方法，其特征是白芨共生菌的復(fù)壯的RM改良培養(yǎng)基配方為:蛋白胨2克，葡萄糖20克，磷酸二氫鉀0.46克，磷酸氫二鉀I克，硫酸鎂0.5克，瓊脂15?20克，馬鈴薯200克，蒸餾水1000毫升。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種白芨共生菌的培育方法，其特征是白芨塊莖根消毒處理接入PDA培養(yǎng)基暗培養(yǎng)7～8天，得到菌絲體后，在木屑和闊葉樹樹葉配制的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)，15～20天后從另一端獲取純化菌種，提純菌種轉(zhuǎn)接到滅菌后的RM改良培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)，7～8天后得到菌絲健壯的優(yōu)良菌種，優(yōu)良菌種將原種培養(yǎng)基暗培養(yǎng)，25～30天得到白芨共生菌的原種，將原種接入栽培種培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)，28～36天后得到白芨共生菌的栽培種。使用時(shí)，將白芨共生菌的栽培種埋于土下15～20cm處后，再移栽白芨苗。使用本發(fā)明的白芨共生菌大田種植白芨，移栽后的苗成活率提高20%以上，產(chǎn)量增產(chǎn)40%以上，質(zhì)量有明顯的提高。
【IPC分類】C12R1/645, A01G1/04, A01C1/08, C12N1/14
【公開號(hào)】CN105659979
【申請?zhí)枴緾N201610030269
【發(fā)明人】寸建清
【申請人】云南綠辰生物科技開發(fā)有限公司
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年1月18日