一種杜仲三倍體的選育方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種杜仲三倍體的選育方法，尤其涉及高溫誘導杜仲大孢子染色體加 倍提高杜仲三倍體得率的方法，屬于杜仲三倍體的選育領域。
【背景技術(shù)】
[0002] 多倍體是指體細胞中含有三個或者三個以上染色體組的個體。多倍體廣泛的存在 于自然界之中，通常來源于體細胞有絲分裂過程中的染色體加倍或減數(shù)分裂過程中產(chǎn)生的 未減數(shù)配子與正常配子雜交。目前常用的人工誘導染色體加倍方式有化學誘導、物理誘導 和生物技術(shù)。
[0003]杜仲屬于二倍體(2n = 2x = 34)，是極具潛力的溫帶膠源樹種。在環(huán)稀醚砲苷類等 藥效成分利用方面也具有重要價值。從目前杜仲的遺傳改良現(xiàn)狀看，盡管杜仲雌雄異株、異 花授粉，但群體內(nèi)個體間的差異性是有限的，很難通過直接選擇優(yōu)株來獲得杜仲膠等次生 代謝產(chǎn)物的大幅度提高；由于杜仲為單科、單屬、單種存在(周政賢.中國杜仲[M].貴州:科 技出版社，1993)，也無法利用種間雜交獲得的雜種優(yōu)勢等。而植物多倍體由于染色體數(shù)目 倍增，常帶來一些形態(tài)和生理上的巨大性變化，如細胞體積增大、葉片增大變厚、代謝物含 量增多等。從代謝產(chǎn)物變化看，三倍體漆樹的產(chǎn)漆量比二倍體高出1-2倍（尚宋燕，張繼祖 等.漆樹染色體觀察及三倍體漆樹的發(fā)現(xiàn)[J].西北植物學報，1985，5(3): 187~191);四倍 體橡膠的產(chǎn)膠量比二倍體親本提高30%以上等(林道拔.橡膠樹多倍體試驗初報[J].熱帶 作物科技，1991 (3): 56-58)。顯然，要想較大幅度地提高杜仲葉片的含膠量，綜合倍性優(yōu)勢 和雜交優(yōu)勢的多倍體育種途徑最為可行。
[0004] 最早朱登云等通過胚乳培養(yǎng)突破性地獲得了大量三倍性胚乳愈傷組織及其再生 植株(朱登云，蔣金火.由杜仲成熟干種子胚乳培養(yǎng)再生完整植株[J].科學通報，1998,4: 307-312)，但對這些胚乳再生植株的鏡檢結(jié)果證明，其染色體數(shù)目均恢復為二倍體，未能取 得預期效果。王躍華采用不同濃度的秋水仙堿溶液對杜仲種子進行不同時間的誘導，發(fā)現(xiàn) 經(jīng)誘導后的材料具有明顯的多倍體特征，用0.4%的秋水仙堿溶液處理48h和用濃度為 0.8%的秋水仙堿溶液處理24h的誘導率都較高(王躍華.杜仲種子的多倍體誘導研究[J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2006,8:73-76)。張海鳳使用不同濃度的秋水仙堿處理剛剛萌發(fā)的種子，獲 得了四倍體，其中〇. 1%處理生長點12h的變異率最高(張海鳳，郭寶林.杜仲四倍體的誘導 與鑒定[J].園藝學報，2008,7:1047-1052)。但是上述的這些傳統(tǒng)的活體誘導處理方法或誘 變率低，或嵌合率高，且獲得的均為同源四倍體，難以實現(xiàn)倍性優(yōu)勢和雜種優(yōu)勢的綜合利 用。
[0005] 杜仲目前尚未發(fā)現(xiàn)天然三倍體，所以必須采用人工誘導的方式。近些年，通過利用 2n配子去誘導產(chǎn)生三倍體被證明是一條非常有效的途徑。高鵬等報道在杜仲小孢子減數(shù)分 裂前期時采用〇 . 1 %_〇. 2%的秋水仙堿處理24h-36h最高可獲得49.5%的2n花粉(高鵬，林 威，康向陽.秋水仙堿誘導杜仲花粉染色體加倍的研究[J].北京林業(yè)大學學報，2004，26 (4): 39-42)。毛彥科等采用"樹木非離體枝芽加熱處理裝置(授權(quán)公告號：101057555B)"處 理發(fā)育到一定程度的雄花芽，可獲得超過40%的2η花粉誘導率，但將2η花粉授粉雜交后并 沒有獲得杜仲三倍體，這可能是由于2η花粉與正常倍性花粉相比，競爭力較差所致（毛彥 科，張平冬，石樂，董春波，索玉靜，康向陽.高溫誘導杜仲2η花粉最佳處理條件研究[J].北 京林業(yè)大學學報，2013,35(1)，53-58)。
[0006] 與利用2η花粉相比，由于利用2η雌配子不存在與單倍性配子競爭問題，受精后2η 雌配子可全部形成三倍體，因此采用2η雌配子選育三倍體更具誘惑力。高鵬利用秋水仙堿、 安磺靈等化學試劑采用不同的處理組合連續(xù)對杜仲雌花芽進行多年處理，花芽均逐漸枯萎 脫落，獲得的苗木經(jīng)染色體檢測后沒有發(fā)現(xiàn)三倍體變異植株(高鵬.杜仲配子與合子染色體 加倍技術(shù)研究[D].北京:北京林業(yè)大學圖書館，2006)。這說明了化學處理誘導大孢子染色 體加倍對雌花芽傷害較大，這種方式可能并不適用于杜仲。而通過極端的溫度變化來誘導 染色體加倍一般是將一、二年生草本植物、可盆栽的小灌木以及可通過切枝水培至種子成 熟的喬木花枝放入恒溫箱中施加高溫處理，獲得2η雌配子再與正常異性配子雜交獲得多倍 體。但杜仲屬于喬木，樹可高達20m，并且種子成熟期長，從受精到種子成熟需要經(jīng)歷7個月， 所以杜仲無法像楊樹一樣先切枝水培后再放入恒溫培養(yǎng)箱中進行高溫處理。毛彥科對非離 體的杜仲雌花芽施加高溫，最終從散粉后第1天48°C高溫持續(xù)處理4h得到了 1株杜仲三倍體 (毛彥科.高溫誘導杜仲配子染色體加倍技術(shù)研究[D].北京:北京林業(yè)大學圖書館，2012)。 但是由于該研究的杜仲三倍體得率太低，導致在生產(chǎn)實踐中無法進行推廣。因此有必要進 一步進行研究，找到在高溫誘導杜仲大孢子染色體加倍過程中最佳誘導參數(shù)，顯著提升杜 仲三倍體的誘導得率，這對于杜仲大孢子染色體加倍選育三倍體以及將該方法引入其他無 法進行離體誘導三倍體的植物具有重要的借鑒意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種杜仲三倍體的選育方法，該方法顯著提高杜仲三倍體誘 導效率，明顯增加了杜仲三倍體誘導的可靠度，為杜仲三倍體的選育創(chuàng)造有利的條件。
[0008] 為達到上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0009] 一種杜仲三倍體的選育方法，包括:對杜仲雌花花芽施加高溫處理后依次進行授 粉、收集種子、播種育苗、倍性檢測;所述的高溫處理是當杜仲雌株周邊的雄株開始散粉后 對杜仲雌花花芽施加42 °C-48 °C的溫度處理。
[0010]其中，優(yōu)選的，對杜仲雌花花芽施加42°C-45°C的溫度處理;更優(yōu)選的，對杜仲雌花 花芽施加45 °C的溫度處理。
[0011]優(yōu)選的，當杜仲雌株周邊的雄株開始散粉后的第1天至第5天中的任何一天對杜仲 雌花花芽施加高溫處理;更優(yōu)選的，當杜仲雌株周邊的雄株開始散粉后的第1天至第4天中 的任何一天對杜仲雌花花芽施加高溫處理;最優(yōu)選的，當杜仲雌株周邊的雄株開始散粉后 的第2天或第3天對杜仲雌花花芽施加高溫處理。其中，在對杜仲雌花花芽施加高溫處理時， 可以采用授權(quán)公告號：1〇1〇57555Β的（實用新型名稱:樹木非離體枝芽加熱處理裝置)進行 高溫處理。
[0012] 所述的高溫處理時間為0.5-8h;優(yōu)選為2-6h;更優(yōu)選為2-4h;最優(yōu)選為4h。
[0013] 本發(fā)明對高溫誘導杜仲大孢子染色體加倍過程中最佳誘導參數(shù)進行了篩選。在杜 仲雌株周邊的雄株散粉后的第1-5天分別施加42°C、45°C、48°C高溫持續(xù)處理杜仲雌株花芽 2h、4h、6h，統(tǒng)計各處理組合的種子數(shù)、成苗數(shù)、三倍體株數(shù)和三倍體得率。結(jié)果表明：共選育 出杜仲三倍體22株。其中，處理溫度對于杜仲三倍體的選育是一個非常關(guān)鍵的因素。當處理 溫度為45 °C時，共選育出20株杜仲三倍體，明顯高于42 °C和48 °C的處理溫度，表明對杜仲雌 花花芽施加45°C的高溫，能明顯提高杜仲三倍體的得率。杜仲雌株周邊的雄株散粉后的天 數(shù)和持續(xù)處理時間對杜仲三倍體選育也具有顯著性的影響。在杜仲雌株周邊的雄株開始散 粉的第5天沒有得到杜仲三倍體，在第1-4天均不同程度的得到了杜仲三倍體，但是存在顯 著差異。周邊的杜仲雄株散粉后第1-4天，分別獲得杜仲三倍體的株數(shù)為2、7、11、2株，表明 當杜仲雌株周邊的雄株開始散粉后第2天和第3天，杜仲三倍體得率較高，明顯高于第1天和 第4天，所以當杜仲雌株周邊的雄株開始散粉后第2天和第3天(第三天效果最好），可明顯提 高杜仲三倍體的得率。另外，對于高溫處理的持續(xù)時間通過比較可以看出：當持續(xù)處理時間 為4h時，共獲得18株杜仲三倍體，顯著高于其他處理時間。通過以上分析，在杜仲雌株周邊 的雄株散粉后第2天和第3天，對雌株花芽施加45°C的高溫持續(xù)處理4h時，分別獲得杜仲三 倍體7和10株，得率分別為3.26%和3.82%，明顯高于其他組合，也明顯高于現(xiàn)有技術(shù)，即對 杜仲雌花芽施加高溫，從散粉后第1天48 °C高溫持續(xù)處理4h得到的1株杜仲三倍體(毛彥科. 高溫誘導杜仲配子染色體加倍技術(shù)研究[D].北京:北京林業(yè)大學圖書館，2012)。
[0014]本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：
[0015]本發(fā)明對能顯著影響杜仲三倍體得率的高溫誘導杜仲大孢子染色體加倍選育三 倍體的處理時期、處理溫度和持續(xù)處理時間等參數(shù)進行了篩選和優(yōu)化，優(yōu)化后的參數(shù)明顯 提高了杜仲三倍體誘導效率，顯著增加了杜仲三倍體誘導的可靠度，大大降低了工作量，有 效的節(jié)約了成本，具有更強的可操作性。